聚球体模型的建立(其林贝尔QL-902使用)

药物引发的肝毒性问题是终止新药研发和导致 药物退市最主要的因素之一，同时也是政府监管行 为最常见的原因之一。如曲格列酮、非阿尿苷等 均因严重肝毒性而被迫撤回。药物引起肝损伤的发 病机制主要有药物直接损害、间接损害( 包括细胞 毒性和胆汁淤积性) 、免疫介导性肝损伤、炎症反 应、线粒体失能以及机体对药物的特异质反应。在 相关发病机制中，我们对胆汁淤积性肝毒性知之甚 少，其临床前预测也仅限于评估药物抑制胆盐输出 泵的能力，缺乏完善的评价标准。

1 药品与试剂 

ASP，APAP，Nef，Tol，FA( 美国 Cayman 公司) ; Tro( 美国 ＲD 公司) ; Iso( 美国 Enzo 公司) ; 青霉素、 链霉素、胎牛血清、Willams'Medium E 培养基( Gibco 公司) ; 引物合成( Invitrogen 公司) ; TＲNzol 总 ＲNA 提取试剂、DL2，000 DNA Marker ［TaKaＲa( 宝生物) 公司］; 抗体( Abcam 公司) 。 

2 仪器 

ＲT-PCＲ 试剂盒、cDNA 反转录试剂盒( Qiagen 公司) ; 96 孔板( 美国 Corning 公司) ; CO2 培养箱 ( 美国 ThemoForma 公司) ; CCK8 试剂盒( 日本同仁 化学研究所) ; 尿素检测试剂盒( Abcom 公司) ; QL-902 涡旋振荡仪( 海门市其林贝尔仪器制造有限公 司) ; Centrifuge 5415D 离 心 机 ( Eppendorf 公 司) ; NANODＲOP 2000 分光光度计( Therno Scientific 公 司) ; Tanon 1600 凝胶成像系统( 上海天能科技有限 公司) ; ABI7500 荧光定量 PCＲ 仪( Applied Biosystems 公 司) ; ELX 800 酶标 仪 ( 美 国 Bio-Tek 公 司) ; HＲ220 掌上离心机( Servicebio 公司) ; Nikon Eclipse E100 正置荧光显微镜( 日本尼康公司) 。 

3 细胞 

HepG2 细胞( 本实验室冻存) ; HepaＲG 细胞( 美 国 Millipore 公司) 。 4 2D 及 3D 细胞培养 HepaＲG 和 HepG2 细胞接种于含 10% 胎牛血 清，100 μmL － 1青霉素、100 μg·mL － 1链霉素、4 mmol· L － 1 L-谷氨酰胺的 Williams'Medium E 培养基中，于 5% CO2 的 37 ℃ 恒温培养箱中培养，达到 70% ～ 80% 融合时，吸弃培养基，PBS 清洗，加胰酶镜下观 察细胞回缩变圆时终止消化，加少量培养基轻轻吹 打制备细胞悬液，并传代。3D 培养条件下，将 HepaＲG 分别以每孔 100，200，400，800，1 600 个接种于 U 型底低吸附 96 孔板中，于 37 ℃，5% 的 CO2 培养 箱中培养，形成3D 微球结构，可持续培养28 d，其间 通过镜下观察球体变化并记录其直径大小。

通过优化实验条件成功构建了 3D HepaＲG 肝毒性评价模型，能够从一定程度上反映出该 体外模型的优势，也可以为胆汁淤积性肝损伤的研 究提供一定的借鉴，但论据尚不充分，在接下来的研 究中，将利用高内涵筛选技术检测化合物对细胞活 力、代谢凋亡及信号转导等各个环节的影响，进一步 探明引起药物肝损伤的毒性机制，从而为化合物的 安全性预测提供实验依据。

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