胰脂肪酶靶点占有率模型建立-贝尔QL-866使用

胰脂肪酶是一种由动物或人类胰腺分泌的水 溶性脂肪分解酶，在甘油三酯的消化中发挥着重要胰脂肪酶是一种由动物或人类胰腺分泌的水 溶性脂肪分解酶，在甘油三酯的消化中发挥着重要发生率的逐年上升，药物治疗成为治疗肥胖症的有 效手段之一。

１ 材料与方法 

１．１ 仪器与软件 

ＴＵ－１８１０紫外可见分光光 度 计（北 京 普 析 通 用 仪 器 有 限 责 任 公 司）；ＭｕｌｔｉＳｋａｎ ＦＣ酶标仪［赛默飞世尔科技（中国）有限公司］；QL-866涡旋混合器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；ＤＺＫＷ－４电热恒温水浴锅（北 京 中 兴 伟 业 仪器有限 公 司）；ＦＡＩ６０４万 分 之 一 天 平（上 海 天 平 仪器厂）；ＪＡ５００３Ｂ千分之一天平（上海越平仪器有 限公司）；ＳｉＧｍＡ 高速冷冻离心机（北京五洲东方科 技发 展 有 限 公 司）；Ｂｒａｎｄ 移 液 枪 （德 国 Ｂｒａｎｄ 公 司）；ＫＱ５２００Ｅ超声波清洗器（昆山市超声仪器有限 公司）；ＳＴＡＲＴＥＲ２１００ＰＨ 计（深圳市展华仪器仪 表 有 限 公 司 ）；ＧａｓｔｒｏｐｌｕｓＴＭ （Ｖｅｒｓｉｏｎ９．５．０００４ ＳｉｍｕｌａｔｉｏｎｓＰｌｕｓＩｎｃ．，Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，ＣＡ，ＵＳＡ）； ＡＤＭＥＴＰｒｅｄｉｃｔｏｒＴＭ软件（Ｖｅｒｓｉｏｎ８．１．０．０）。 

１．２ 试 剂 

猪 胰 脂 肪 酶 （上 海 源 叶 生 物 有 限 公 司）；对硝基苯基棕榈酸酯（Ｐ－ＮＰＰ）（≥９８％，阿法埃 莎化学有限公司）；脱氧胆酸钠（纯度：＞９９．０％，上海江莱 生 物 科 技 有 限 公 司）；二 甲 基 亚 砜（ＤＭＳＯ） （北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）；磷酸二氢 钠、异丙醇、高 氯 酸（北 京 化 工 厂）、氢 氧 化 钠（天 津 市光复科技发展有限公司）均 为 分 析 纯；奥 利 司 他 （纯度：≥９８％，中山万汉医药科技有限公司）、新利 司他（纯度：≥９８％，上海源叶生物科技有限公司）； 娃哈哈饮用纯净水（杭州集团娃哈哈有限公司）。 

１．３ 方法 

１．３．１ 胰脂肪酶溶液的制备 

精密称定胰脂肪酶 １００ｍｇ，于 ５０ ｍＬ 离 心 管，加 入 １０ ｍＬ 冷 的 ５０ ｍｍｏｌ·Ｌ－１磷 酸 盐－５ｍｍｏｌ·Ｌ－１脱 氧 胆 酸 钠 缓 冲 液 （ｐＨ８．０），３０００ｒ·ｍｉｎ－１涡旋５ｍｉｎ，４ ℃下离心半 径７．４ｃｍ，７０００ｒ·ｍｉｎ－１离心１０ｍｉｎ，倾出上清液 至一新的离心管，即得。使用时保存在０～６℃冰水 浴环境。 

１．３．２ 胰脂肪酶抑制剂ＩＣ５０的测定 

精密称取奥 利司他、新 利 司 他 各 １０ ｍｇ 至 于 １０ ｍＬ 量 瓶 中， ＤＭＳＯ 溶解并 定 容，冷 藏 储 存，使 用 前 取 出 室 温 融 化，摇匀后以缓冲液稀释得系列不同浓度的抑制剂 溶液（奥利司他终浓度０～２８８０ｎｍｏｌ·Ｌ－１；新利司 他终浓度０～６１４４ｎｍｏｌ·Ｌ－１）。分别取０．３ｍＬ抑 制剂溶液和上述已制备的酶溶液于试管中，加缓冲 液补至２．７ｍＬ，摇匀，３７ ℃水浴温孵１５ｍｉｎ，加入 １ｍｍｏｌ·Ｌ－１ｐ－ＮＰＰ底物溶液０．３ｍＬ，３７℃水浴１０ ｍｉｎ后立即于４０５ｎｍ 测定其吸光度，空白以等量不 含抑制剂的 溶 液 代 替，每 组 反 应 平 行３次。ＩＣ５０计 算采用公式（１），其中 Ｋ 为曲线的上限值，ａ为增长 速度，采用三参数ｌｏｇｉｓｔｉｃ曲线拟合求解。

２ 结果

胰脂 肪 酶 作 用 于 Ｐ－ＮＰＰ分解出 对 硝 基 苯 酚 （Ｐ－ＮＰ），该 产 物 在 ４０５ ｎｍ 处有吸收峰，浓度 与 吸 光 值 成 正 比。测 定 奥 利 司他、新利司他在不同浓度条件下与酶反应后的 吸光度，从 而 得 出 其 对 胰 脂 肪 酶 的 抑 制 活 性。奥 利司他、新利司他对胰脂肪酶的抑制考察，随着抑制剂浓度的增大，抑 制 率 快速增大，最 大 抑 制 率 均 近１００％。采用 公 式（１） 计算得奥利司他的ＩＣ５０为１９．１ｎｍｏｌ·Ｌ－１，新利 司 他的ＩＣ５０为７６ｎｍｏｌ·Ｌ－１。

３ 讨论 

奥利司他和新利司他作为强效的胃肠道脂肪 酶抑制剂，是目前公认的用于治疗肥胖症的药 物。 本研究测定得 奥 利 司 他 的ＩＣ５０为１９．１ｎｍｏｌ·Ｌ－１， 新利司他的ＩＣ５０为７６ｎｍｏｌ·Ｌ－１，均为纳摩尔级抑 制。尽 管ＩＣ５０对 评 估 药 物 对酶的潜在抑制作用有较大的价值，但因其只能反 应药物－靶标结合的平衡状态，不能反映整个结合的 动力学过程，且无法预测药物对酶抑制的快慢和作 用持续的时间等，存在较大局限性使其无法与体内 的药效活性建立关联。

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