用其林贝尔QL-901对生物活性限值检测

1 材料 

1.1 细胞 

大鼠心肌细胞株 H9c2（购买于中国医学科学 院协和医学院基础医学细胞中心）。 

1.2 药品与试剂

 附子样品共 4 批，购自四川江油中坝附子科技 发展有限公司，产地分别为云南（批号：HSPYN）、 陕西汉中（批号：HSPSXHZ）、四川江油（批号：HS PSCJY 和 HSPSCJY1）。 新乌头碱（中国食品药品检定研究院，批号： 110799-201608）；DMEM 培养基（美国 HyClone 公 司，批号：AE25719272）；胎牛血清（美国 Gibco 公 司，批号 A10112-2770）；0.25 % 胰 蛋白酶（美国 HyClone 公司，批号：MHE86395）；青、链霉素（美 国 Hyclone 公 司，批 号：AB10190291，J170012）； CCK-8（碧云天生物 技 术有限责任公司，批号： 112018190218）；PBS（北京益美源生物科技有限责任公司，11310210）。 

1.3 仪器 

MCO-15A 型 CO2 培养箱（日本三洋电机国际 贸易有限公司）；YUETAN 型超净工作台（北京半 导体设备一厂）；DT5-6A 型台式离心机（北京时代 北利离心机有限公司）；Axioobserver 倒置显微镜 （德国 ZEISS 公司）；Multiskan FC 型酶标仪（美国 Thermo 公司）；ME104E 型电子分析天平（瑞士梅 特勒 - 托利多公司）；其林贝尔QL-901 型涡旋仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；96 孔细胞培养板及培 养瓶（美国 Corning 公司）

2 方法

附子水提物由中国中药有限公司制备，制备方 法如下：分别称取黑顺片 200 g，浸泡 30 min，煎煮 2 次，第 1 次加 9 倍量水，煎煮 30 min，第 2 次加 7 倍量水，煎煮 25 min，200 目筛过滤，65℃减压浓 缩，测定浓缩液密度及干膏得率，冷冻干燥制备成 冻干粉备用。4 个批次（批号：HSPYN、HSPSXHZ、 HSPSCJY、HSPSCJY1）的附子水提物的干膏得率 分别为 21.42%、9.85%、8.79% 和 15.26%。附子水提物：精密称取各批号附子水提物冻 干粉，加入 DMEM 完全培养基溶解。使用 0.22μm 滤膜过滤杂质，配制为 0.25 mg·mL-1 附子水提物 母液，再用 DMEM 完全培养基稀释至相应工作浓 度，现用现配。新乌头碱：精密称取新乌头碱粉末， 加入去离子水溶解，使用 0.22μm 滤膜过滤杂质， 配制为 18 mg·mL-1 母液。冻存于 -20℃，使用时加 入 DMEM 完全培养基稀释至相应工作浓度，现用 现配。H9c2 细胞培养于 DMEM 培养基（含 10 % 胎 牛血清，100 U·mL-1 青、链霉素，4 mM L- 谷氨酰 胺）中，置于 37℃，5%CO2 及饱和湿度的培养箱中 培养。加入 1 mL 0.25% 胰蛋白酶按照 1：3 比例传 代培养。取对数生长期细胞进行后续实验。

3 结果

结果显示，各密度下 H9c2 细胞在 0 ～ 48 h 为 增殖期，48 ～ 60 h 到达平台期，60 ～72 h 进入衰 亡期。当细胞密度为 2×105 /mL 时，细胞生长过快， 不利于下一步实验。故选用 0.5×10/mL 或 1×105 /mL 密度进行下一步实验。预实验结果显示附子水提物最大溶解浓度为 250 μg·mL-1，因而选择最大给药浓度 125 μg·mL-1 作为药物测试浓度；新乌头碱作为阳性对照药，浓 度选择为 100 μg·mL-1。结果显 示，当细胞密度 为 0.5×105 /mL，作用时间为 12 h 时，附子水提物和 新乌头碱对细胞增殖抑制作用较强，且作用稳定， RSD<15%。故选用 0.5×105 /mL，药物作用 12 h 进 行后续实验。

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