静音混合器在扶脾柔肝方分析中的使用

肝纤维化（hepatic fibrosis，HF）-肝硬化-肝癌是 慢性肝病发展中的三步曲，HF 与早期肝硬化是可逆 的，因此阻止及逆转 HF 的发展，揭示 HF 新的发病 机制，一直是肝病研究的热点。自噬在 HF 的发病机 制中发挥着重要的作用。肝细胞自噬可适应急性应 激，亦可导致肝细胞自噬性死亡。

SD 大鼠 70 只，SPF 级，5 周龄，雌雄各 半，体质量 140～180 g，由南通大学实验动物中心 提供，实验动物许可证号：SCXK（苏）2014-0001， 合格证编号：NO. 201600292。

FRF 组成：黄芪（批号：1504001w）7.5 g、 白术（批号：1502001w）6 g、苡仁（批号：1502001s） 6 g、 丹 参（批 号 ： 1503002s）4.5 g、 当 归（批 号 ： 1502002w）4.5 g、牛膝（批号：1502001w）6 g、莪术 （批号：1503001w）1.5 g、苍术（批号：1502001w）2.5g、枳壳（批号：1410001w）2.5 g，配方颗粒剂为华润 三九医药股份有限公司产品，由贵州中医药大学第 一附属医院中药房提供。秋水仙碱片（国药准字 H53021904），玉溪生物制药有限公司。扶正化瘀胶 囊（国药准字：Z20020073），上海黄海制药有限责任 公司。

谷丙转氨酶（ALT，批号：2015035）、谷 草转氨酶（AST，批号：2015013）、白蛋白（ALB，批 号：2015030）、γ-谷氨酰基转移酶（γ-GGT，批号： 2016001）及总胆红素（TBIL，批号：2016013）试剂 盒，均为长春汇力生物技术有限公司产品；α-SMA， （批 号 ： E1A1032）、 Beclin- 1（批 号 ： E1A5128）、 LC3-Ⅱ（批号：E1A4007）、GAPDH（批号：E1C604- 1）抗体、HRP 标记的羊抗兔二抗（批号 E1WP318）、 RIPA 裂解液、BSA、预染蛋白 Marker、显影液、定 影液、BCA 蛋白浓度检测试剂盒，均购自南京恩晶 生物科技有限公司；ECL 化学发光试剂（批号： P0018A），上海碧云天生物技术公司；DMSO，美国 Sigma 公司；PVDF 膜，美国 Millipore 公司；Maxisignal Western Solution（SUDGEN，批号：15101215/16），南 京南晶生物公司； TRIpure Reagent（Aidlab，批号： 272026AX）， 北 京 艾 德 莱 生 物 公 司 ； OneScriptTM cDNA Synthesis Kit（G234）、 EvaGreen Express2 × qPCR Master Mix-ROX，均为加拿大 ABM 公司产品。

ECA-2000A 型全自动生化分析仪，吉林 维尔医疗器械有限公司；VE 180 型微型垂直电泳 槽、VE 186 型转移电泳槽、EPS 300 型电泳仪，上 海天能科技有限公司；TY-80B 型脱色摇床，江苏省 金坛市荣华仪器制造有限公司；WH-986 型静音混合 器 ， 江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司 ； BSA224S 型 精 密 电 子 天 平 ， 德 国 Satorius 公 司 ；MUTISKAN MK3 型酶标仪，美国 Thermo scientific 公 司；TL998-IV 型 Real time PCR 仪，西安天隆科技 公司；TC1000-G 型梯度 PCR 仪、D3024R 型低温离 心机，美国 SCILOGEX 公司；FA2004 型电子天平， 上海上平仪器有限公司；H-7500 型透射电镜，日本 HITACHI 公司。

结果见表 1。实 验造模前各组大鼠体质量比较，差异无统计学意义 （P＞0.05）。造模 4 周时，各造模组体质量均低于正 常组，除 FRF 中剂量组外，差异均有统计学意义 （P <0.05）；各造模组间比较，差异无统计学意义 （P＞0.05）。造模 8 周结束时，各造模组体质量仍低 于正常组，除模型组、FRF 中剂量组外，差异均有 统计学意义（P < 0.05）；各造模组间比较，差异无统 计学意义（P＞0.05）。药物干预 4 周结束时，各药物 干预组体质量仍低于正常组，除模型组、FRF 中剂 量组外，差异均有统计学意义（P < 0.05）；但与模型 组比较，各给药组的体质量差异无统计学意义（P＞ 0.05）。提示 HF 造模能影响大鼠体质量，但阳性药 及 FRF 的干预作用不明显。正常组比较，模型组的 ALT、AST、γ-GGT、TBIL 含量显著增高（P < 0.05，P < 0.01），ALB 含量显著 降低（P < 0.01）。与模型组比较，FRF 各剂量组的 ALT、AST、TBIL 均显著下降（P < 0.05，P < 0.01）， ALB 含量显著升高（P < 0.05，P < 0.01），FRF 中、 高剂量组的 γ-GGT 显著下降（P < 0.05，P < 0.01）。Masson 切片显示正常组仅于汇管区有少量蓝染的胶原纤维分布，无明显胶原增生。与正常组 比较，模型组大鼠的门管区蓝染纤维组织增多，中 央静脉壁增厚，多数大鼠蓝染的纤维组织自门管区 或中央静脉向外延伸，少数大鼠有纤维隔形成，呈 蓝染；HF 程度分级经非参数检验，与正常组比较差 异有统计学意义（P＜0.01）。与模型组比较，给药组 大鼠的肝纤维组织增生程度均有不同程度的减轻， 胶原纤维减少、变细；肝纤维化程度分级，除 FRF 低剂量组外，差异均有统计学意义（P＜0.01）。

3 讨论

自噬是细胞降解亚细胞结构，维持细胞内环境平 衡的生物过程 。Beclin-1 作用于自噬的起始阶段， 参与自噬体的形成，是自噬启动的关键基因。 LC3-Ⅱ亦参与了自噬体的形成，是定位于自噬体膜 的结构蛋白，与自噬体的数量呈正相关，是反映自噬水平高低的重要指标，是检测自噬活性和自噬体 形成的标志基因。自噬在 HF 的能量代谢中起重要 的作用，能促进 HF 的发生。在 HF 过程中，肝细胞 损伤坏死，而 HSC 活化，两者自噬调控异常是 HF 的重要病理机制。CCl4诱导的 HF 小鼠模型中 LC3- Ⅱ表达增加，体外激活的小鼠 HSC 存在自噬流量增加，提示自噬与 HSC 活化关系密切。自噬通过降 解脂滴为 HSC 转化为 MFB 提供能量，MFB 大量合 成胶原纤维，促进 HF 的发生与发展 。自噬对肝细 胞而言是一把双刃剑，可能帮助其生存，也可能促 进炎症而损害肝细胞。自噬对 HSC 具有保护作用， 能为 HSC 表型转化提供能量，促进 HF。自噬参与了 HF 发生的多个环节，可能参与肝细胞变性坏死，亦 可能助其存活，而在 HSC 活化过程中自噬显著增 加，自噬抑制剂能抑制 HSC 活化，抑制 HSC 向肌成 纤维细胞（MFB）转化。