浅谈大鼠血浆中阿霉素含量测定方法

阿霉素( Doxorubicin，Dox) 又名多柔比星，是一 种蒽环类糖苷化合物，临床上多用其盐酸盐。阿霉 素主要通过嵌入 DNA 抑制核酸的合成，起到杀灭细 胞的效果。Dox 是一类广谱的抗肿瘤药物，临床 上被广泛用于治疗急性白血病、霍奇金和非霍奇 金淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、 肝癌等多种恶性肿瘤。Dox 的主要不良反应常表 现为心脏毒性、骨髓毒性、抑制免疫功能以及恶心、 呕吐等。因其不良反应较大，临床上多将其作 为二线药物。硫酸软骨素( CS) 具有抗氧化、抗 炎、抗动脉粥样硬化、抗肿瘤等药理活性， 目前用于防治心脑血管疾病、骨关节炎、神经保护 等。我们采用 CS 修饰 Dox 可以赋予 Dox 良好的肿瘤靶向性，提高 Dox 的靶向性和生物利用度，在降低 其不良反应的同时增强了 Dox 的抗肿瘤效果。

猪 CS 111014-01( Mw = 17. 5 kDa，华懋双汇实 业( 集团) 有限公司生物化学制药厂) ; 低分子量猪 ( Mw = 4. 1 kDa，自制) ; Dox·HCl( 97% ，北京偶合 试剂有限公司) ，CS-Dox( 自制) ，乙二胺四乙酸二钠 ( 分析纯，国药试剂有限公司) 。其他试剂均为国产 分析纯。

Cary Eclipse 荧光分光光度计( 美国 Varian 公 司) ，TF-FD-1 冷冻干燥机( 上海田枫实业有限公 司) ，Vortex QL-902 涡旋仪( 江苏海门其林贝尔仪器 制造有限公司) 。 1. 3 实验动物 SD 大鼠( 雄性，200 ± 20 g) ，购买于济南朋悦实 验动物繁育有限公司。( 许可证号: SCXK( 鲁) 2014- 0007)

选用荧光分光光度法测量血浆中 Dox 的含量。 Ex 480 nm，Em 500 ～ 800 nm 扫描，可以得到在 Em 593 nm 处有较高峰，故本实验检测条件选用 Ex 480 nm，Em 593 nm，激发与发射狭缝均设定为 10 nm。

实验前 SD 大鼠禁食不禁水 12 h，实验大鼠乙 醚麻醉，眼内眦取血，采集的空白血液标本放入到装 有 EDTA 二钠的离心管中，3000 r/min 离心 10 min， 取上清，即得空白血浆样品。

精密称取 Dox·HCl 1. 25 mg 加水定容到 25 ml 的容量瓶中，配制 50 μg /ml 的 Dox 溶液作为储备 液。精密吸取储备液( 0. 04 ml、0. 10 ml、0. 20 ml、 0. 40 ml、1. 00 ml、2. 00 ml、4. 00 ml、6. 00 ml) 放入10 ml 容量瓶中加水定容，配制相应浓度( 0. 2 μg /ml、 0. 5 μg /ml、1、2 μg /ml、5 μg /ml、10 μg /ml、20 μg / ml、30 μg /ml) 的 Dox 溶液，4 ℃避光保存待用。

精密吸取 8 份大鼠空白血浆 200 μl 放入 1. 5 ml 离心管中，每个离心管中分别加入不同浓度的盐 Dox 溶液 200 μl，涡旋混匀，使得血浆中 Dox 的浓度 分别为 0. 1 μg /ml、0. 25 μg /ml、0. 50 μg /ml、1. 00 μg /ml、2. 00 μg /ml、5. 00 μg /ml、10. 00 μg /ml、 15. 00 μg /ml。在 2. 1 中的检测条件下测定荧光强 度值。以溶液浓度为横坐标，最终荧光强度值( Y) 为纵坐标，绘出其荧光标准曲线并求得工作曲线的 回归方程。

取大鼠空白血浆 200 μl，1∶ 1 加入低、中、高三 种浓度的 Dox 溶液，配制 Dox 浓度分别为 0. 25 μg / ml、5. 00 μg /ml、15. 00 μg /ml 的血浆样品。将血浆样品按 2. 4 中的处理方法处理测定其荧光强度，每 3 h 测定 1 次，测 3 次，计算日内精密度，连续测量三天，计算日间精密度。

将配制一系列标准溶液放入荧光分光光度计中 测量得到 593 nm 处的荧光强度值，以溶液浓度为横 坐标，最终荧光强度值( Y) 为纵坐标，绘出其荧光标 准曲线( 见图 1) ，并求得工作曲线的回归方程: Y = 16. 944X + 0. 6796 ( Ｒ2 = 0. 9997 ) 。结 果 表 明，Dox 在 0. 1 ～ 15 μg /ml 的浓度范围内，荧光强度值与浓 度线性关系良好。从 表中可知阿霉素血浆溶液日内 ＲSD 值小于 3% ，表 示该检测方法测定的日内精密度良好。从表中可知，Dox 血浆溶液日间 ＲSD 值小于 3% ，表示 该检测方法测定的日间精密度良好。对空白血浆、Dox 水溶液和 Dox 血浆溶液进行 荧光发射图谱扫描，从图中我们可 以看出，5 μg /ml Dox 血浆溶液的荧光发射图谱与 5μg /ml Dox 血浆溶液水溶液的荧光发射图谱，基本 重合，说明方法可行。血浆中 Dox 稳定存在，荧光图 谱为 Dox 专属。

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