其林贝尔分析小鼠胚胎成骨细胞的增殖分化的影

骨质疏松症( osteoporosis，OP) 是一种以骨质量 减少和骨组织微结构破坏为特征，导致骨脆性增加 和骨折风险提高的代谢性骨病。当前 OP 的治疗主要以药物为主，非药物治疗为辅。除了传统的药 物，研究者发现血管紧张素转换酶抑制剂( angiotensin-conversting enzyme inhibitors，ACEI) 类药物同样有改善骨质疏松的作用。

小鼠胚胎成骨细胞前体细胞 MC3T3-E1 购于中国科学院上海生命科学研究院。

α-MEM 完 全 培 养 基、胎 牛 血 清 ( FBS) 、0． 25% 胰蛋白酶溶液( 美国 Gibco 公司) ; 茜 素红染液( 质量分数 1%，pH 4． 2，广州翔博生物公 司) ; 培哚普利·叔丁胺盐( MCE 中国公司) ; DMSO ( 美国 Sigma 公司) ; 锥虫蓝( 广州翔博生物公司) ; CCK-8 试剂盒( 日本同仁化学研究所) ; ALP 检测试剂 盒、BCA 蛋白定量试剂盒、TritonX-100、β-甘油磷酸 钠、抗坏血酸和地塞米松( 广州翔博生物公司) 。

iMark 酶标仪( 美国 BIO-ＲAD 公 司) ; Thermo FOＲMA 370 CO2 细胞培养箱( 美国密理博公司) ; BCM-1000A 生物洁净工作台( 中国苏净集团苏州安泰公司) ; 202A-1 型数显电热恒温干燥 箱( 上海悦丰仪器仪表有限公司) ; OLYMPUSCK40 倒置显微镜( 日本 Olympus 公司) ; 可见光分光光度 计 722s( 上海棱光技术有限公司) ; TS-8 脱色摇床 ( 江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司) ; 超低温冰 箱( 美国 Forma 公司) 。

精确称取 50 mg 抗坏血酸， 充分溶于10 mL ddH2O 中，用直径为22 μm 的细针过 滤器过滤后，于 4℃冰箱中保存，每 100 mL 培养基中 加入该溶液 1 mL，使其质量浓度为 50 mg·L － 1 。

精确称取 2． 16 g β-甘 油磷酸钠溶于10 mL ddH2O 中，用直径为22 μm 的细 针过滤器过滤后，于 4℃冰箱中保存，每 100 mL 培养 基中加入该溶液 1 mL，使其浓度为 10 mmol·L － 1 。 1． 5 细胞鉴定 采用传代细胞培养方法培养和建 立成骨细胞系 MC3T3-E1 细胞实验模型，并通过观 察其生物形态及用茜素红行钙结节染色对细胞进行基本鉴定。细胞常规培养于含有 10% 胎牛血清的 α-MEM 完全培养基中，5% CO2 37℃孵箱中培养，待 细胞融合度达 90% 时，0． 25% 胰酶消化，按 1∶ 3 比 例进行传代培养。取生长良好的细胞调整细胞浓度 后接种于 6 孔板中，每组培养基中均加入诱导液作 为诱导培养基，设不加培哚普利的诱导培养基为空 白对照组。培养 7 d 后，用 10% 甲醛室温固定后，加 入茜素红染液染色，37℃ 孵育，再用 PBS 孵育，去除 残留染色液后显微镜下观察钙结节染色情况。

倒置显微镜下观察，可见 MC3T3-E1 细胞贴壁生长，细胞呈长梭形，胞体丰满，具有少量短的突触，中央胞核呈椭圆形或圆形， 核仁清晰。培养至第 3 天，细胞长满培养 瓶底，呈放射状、漩涡状排列，细胞间互相接触外观 似“马赛克”样。肉眼可见到细胞爬片上不均匀着 色，镜下观察到细胞基质中有矿化结节形成，结节大 小、形态不一。第 7 天观察时镜下可见各组 细胞均有红色的矿化结节形成，随培养时间延长染 色面积增大，钙结节密度增高; 第 14 天时结节轮廓 清晰，结节间距较大; 培养至 21 d 时结节面积增大， 有的结节边界甚至超出视野。结合细胞形态和钙结 节可初步鉴定该细胞为 MC3T3-E1 细胞。因此采用 传代细胞培养法培养建立成骨细胞系 MC3T3-E1 实 验细胞模型是成功的，可进行下一步实验。

实验结果显示，48 h 时 1 ×10 － 5 和 1 ×10 － 6 mol· L － 1 有促细胞增殖的能力，提示此 2 种浓度的培哚普 利在足够长时间的作用下可促进成骨细胞增殖，而 余浓度在实验的时间里均未有促进细胞增殖作用， 说明培哚普利促进 MC3T3-E1 细胞增殖的适宜浓度 为低浓度。目前的研究表明，MC3T3-E1 细胞能够 产生 ACE，表面存在 AT1、AT2 受体，培哚普利可抑 制 ACE，但此作用对细胞增殖影响不大，猜测培哚 普利有可能通过激活 MC3T3-E1 细胞中与增殖相关 的信号通路如 wnt 通路、Noth 通路和 BMP-Smads 通 路或增殖相关基因如 c-myc、c-fos 和 c-jun 等，其机制 还需要更多的实验探讨。本实验证明一定浓度的培 哚普利溶液具有促进成骨前体细胞增殖的能力，与 文献报道的 ACEI 另一种药卡托普利作用于 MC3T3-E1 细胞相似，推测培哚普利可以通过促进成骨前体细胞数量增加发挥其成骨作用，为骨形成 提供细胞基础研究。



 

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