浅谈成骨细胞增殖分化中的成分

淫羊藿苷( ICA) 是中药淫羊藿的有效成分。淫 羊藿为小檗科多年生草本植物，归肝、肾经，性温，味 辛、甘。《本草纲目》记录了淫羊藿其有“益精气、坚筋骨、实腰膝心力”的效果。淫羊藿苷是从淫羊藿 属植物中分离得到的黄酮醇苷类化合物。对治 疗骨质疏松症类疾病效果显著且不良反应小。淫羊 藿及淫羊藿提取物通过对骨髓间充质干细胞诱导作 用来激活成骨细胞的增殖分化及抑制破骨细胞的作 用来促进骨的形成、抑制骨吸收，构建骨的平衡，进 而有效地防治骨质疏松的发生发展。淫羊藿苷 的分子机制已经证明其抗骨质疏松和成骨分化作 用以及其参与雌激素生物合成。

出生 72 h 的 SD 乳鼠，由黑龙江中医药大学动 物 实 验 中 心 提 供。动物合格证编号为 SCXK 黑 2015004。

淫羊 藿 苷 ( meilunbio，中 国) ，LiCl ( Sigma，美 国) ，胎牛血清、DMEM 培养基、青霉素-链霉素混合 液和 胰 酶 ( Hyclone，美 国) ，CCK8 ( 同仁，日 本) ， GSK3β、p-GSK3β、β- catenin、GAPDH 抗 体 购 于 Abcam 公司，维生素 C、β-甘油磷酸钠、地塞米松 ( Sigma，美国) 。茜素红染液( 索莱宝，中国) ，PNPP ( 大连美伦，中国) 。

无菌条件下取出出生 72 h 的 SD 乳鼠头骨，置 入 4°C 的 PBS 溶液中，然后应用眼科镊与手术刀剔 除表面的结缔组织，用 4°C 的 PBS 溶液反复吹打清 洗组织并将其剪成小于 1 mm3 的组织块，将剪好的 组织块转移到 1. 5 mL 离心管中，加 3 倍体积的胰 酶，将离心管置入 37 ℃ 的脱色摇床（TS-1000型）中进行消化，振 荡消化 20 min 后加入胎牛血清终止消化，放置于 4 ℃ 冰 箱 中 静 置 5 min，舍 弃 上 清 液，加 入 0. 2% Collagenase I，置于 37 ℃的脱色摇床中，消化并振荡 60 min 后用胎牛血清终止消化，多次吹打后通过 200 目滤网过滤去除碎片，收集滤液，1 200 r /min 离心 8 min，弃上清液，用 DMEM 完全培养基进行重 新悬浮细胞，置于 37 ℃，5% CO2 培养箱中进行培 养; 2 d 后换液，之后间隔 2 ～ 3 d 换 1 次培养液。并在倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况，取培养 的第三代成骨细胞进行后续实验。

称取一定量的 ICA，用 DMSO 溶解，配制成为 200 μmol /L 的 ICA 贮备液，使用前用 DMEM 基础培 养液稀释所需浓度，使 DMSO 的终浓度＜ 0. 1%。将 成骨细密度调整为 104 /mL 接种于 96 孔培养板中进 行培养，每孔加入 200 μL 置于 5% CO2 的 37 ℃ 培 养箱中进行培养，待细胞长满瓶底 80%以上每孔中 加入 ICA 终浓度为 0、10、20、40、80 nmol /L 进行继 续培养 24 h 后，每孔中加入 10 μL 的 CCK-8 进行继 续培养 4 h 后，用酶标仪读取波长为 490 nm 处的吸 光度值。

将成骨细胞密度调整为 104 /mL 接种于 96 孔培 养板中进行培养，每孔加入 200 μL 置于 5% CO2 的 37 ℃培养箱中进行培养，待细胞长满瓶底 80%以上 每孔中加入 LiCl 终浓度为 0、2、5 nmol /L 进行继续 培养 24 h 后，每孔中加入 10 μL 的 CCK-8 进行继续 培养 4 h 后，用酶标仪读取波长为 490 nm 处的吸光 度值。

将成骨细胞细密度调整为 104 /mL 接种于 96 孔 培养板中进行培养，每孔加入 200 μL 置于 5% CO2 的 37 ℃培养箱中进行培养，待细胞长满瓶底 80% 以上时将相应的孔板分为 4 组即空白组、ICA 组( 80 nmol /L) ，LiCl( 5 nmol /L) ，ICA( 80 nmol /L) +LiCl( 5 nmol /L) 组，加入相应的药物，继续进行培养 24 h， 每孔中加入 10 μL 的 CCK-8 进行继续培养 4 h 后， 用酶标仪读取波长为 490 nm 处的吸光度。

用第三代成骨细胞进行成骨性诱导，在矿化诱 导培养基( 100 nmol /L 抗坏血酸、10 mmol /L β-甘油 磷酸、7 mol /L 地塞米松) 下培养。各组分别加入相 应浓度药物。接种于培养板中，分为空白组( 矿化 诱导培养基) 、ICA 组( 80 nmol /L) ，LiCl 组( 5 nmol / L) ，ICA( 80 nmol /L) +LiCl( 5 nmol /L) 组，空白组给 予空白诱导培养液，进行诱导 21 d 后弃掉培养液， 培养板用 PBS 溶液冲洗 3 次，室温下使用 95%乙醇 固定 15 min，双蒸水冲洗 3 次，0. 1%茜素红［茜素 红-Tris-Hcl( pH 8. 3) ］染色，放置培养箱中 1 h，使用 双蒸水冲洗 3 次。PNPP 法测定成骨细胞 ALP 活 性，成骨细胞培养 21 d 后弃培养液，应用 PBS 溶液冲洗 2 遍，使用 1% Triton X-100 反复冻融 3 次，成 骨细胞裂解物孵育在磷酸盐底物中 30 min，温度为 37 ℃，进而加入 1 mol /L 的 NaOH 终止反应，酶标仪 在 405 nm 下测定其吸光度值。根据蛋白质标准化 的 Sigma 校正曲线，计算各组成骨细胞酶活性。

将成骨细胞在倒置显微镜下观察，接种 24 h 左 右细胞贴壁，继续培养 72 h 延伸出较多的突起，在 培养到 7 ～ 10 d 后细胞融合为单层细胞，细胞多为 单核、多边形及梭形等，如图 1 所示。CCK-8 法检测结果显示与空白组 比较，ICA 组、LiCl 组和 LiCl 与 ICA 联合组对成骨 细胞的增殖具均有促进作用，与淫羊藿苷组和氯化 锂组比较，淫羊藿苷联合氯化锂组对成骨细胞的增 殖更具有明显促进作用。，CCK-8 法检测结果显示一定浓度 下氯化锂都能对成骨细胞增殖产生不同程度的促进 作用，并且各不同浓度组的 OD 值比较，差异具有统 计学意义。CCK-8 法检测结果显示不同浓度 的 ICA 都能对成骨细胞增殖产生不同程度作用，但 是低浓度差异不显著。成骨细胞生长率随着淫羊藿 的浓度升高而增加。结果表明淫羊藿 苷、氯化锂、淫羊藿苷联合氯化锂处理的成骨细胞的矿化能力明显增加，相对于空白组，ICA 组、LiCl 组 和 LiCl 与 ICA 联合组的成骨细胞矿化能力明显增 加，与 空 白 组 比 较，差异具有统计学意义 ( P ＜ 0. 05) ，且以 LiCl 与 ICA 联合组处理细胞钙化能力最强。

3 讨论

骨质疏松症是以骨的微观结构减弱为主要表现 特征，骨强度下降和骨脆性增加为主要临床表 现，多发生于老年人群，严重危害着患者的生活 质量。骨质疏松由于成骨细胞与破骨细胞生理状态 异常所致。近年来的研究已经证明，淫羊藿苷可 通过上调成骨细胞核心结合因子 α1 ( Cbfα1) 、 BMP-2、BMP-4 mＲNA 和 Ｒunx2 的表达而促进成骨 细胞骨形成。经典 Wnt /β-catenin 信号通路在成骨细胞的生 成及骨形成过程中起到重要的作用，而淫羊藿苷+ 氯化锂组通过调节 Wnt 信号通路 GSK-3β 的磷酸化 从而抑制胞质内 β-catenin 的磷酸化和降解，进而增 加胞质内 β-catenin 聚集并转入细胞胞核。从而激 活下游靶基因促进成骨细胞分化。



 

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