蛋白酶对脱脂羊乳发酵产抗氧化肽的影响

越来越多的调查显示，心血管疾病、癌症、 糖尿病以及阿尔兹海默症患者在逐年增加，而 引起这些疾病的主要原因是氧化应激反应。氧 化应激是体内氧化与抗氧化作用的平衡被破坏， 从而产生过多的自由基，这被认为是导致衰老和 疾病的一个重要影响因素。因此，抗氧化剂的研 究成为了近年来的热点方向。抗氧化肽是天然抗 氧化剂的一种，有着良好的抗氧化性，可以有效 清除体内多余的自由基，从而降低衰老和患病的风险。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种与培养基

植物乳杆菌(L. plantarum， LP)L60：实验室保藏；脱脂羊乳粉：富平县秦源 乳业有限公司。 MRS肉汤培养基(g/L)：蛋白胨10.0、酵母粉 4.0、磷酸氢二钾2.0、乙酸钠5.0、硫酸锰0.04、 牛肉膏8.0、葡萄糖20.0、柠檬酸氢二铵2.0、硫 酸镁0.2、吐温80 1.0，pH5.7±0.2，121 ℃灭菌15 min。 复原羊乳培养基：将脱脂羊乳粉与蒸馏水混 合配制成浓度为14%的复原羊乳，90 ℃灭菌15 min。 发酵培养基：复原羊乳14%，氯化钠1.02%、 蛋白胨0.82%、葡萄糖0.72%，于90 ℃巴氏灭菌15 min。

1.1.2 主要试剂与仪器

氯化钠：天津市富宇精细 化工有限公司；蛋白胨：北京奥博星生物技术有 限责任公司；葡萄糖：天津市河东区红岩试剂 厂；Hip-His-Leu(HHL)、木瓜蛋白酶、风味蛋 白酶：美国Sigma公司；Alcalase：丹麦诺维信 公司。 JA6001电子分析天平：北京赛多利斯天平有 限公司；YX-280D手提式压力蒸汽灭菌锅：江阴 滨江医疗设备厂；SW-CJ-1F单人双面超净无菌操 作台：苏州江东精密仪器有限公司；DH5000AB 电热恒温培养箱、DK-98-1电热恒温水浴锅、 WG-71电热鼓风干燥箱：天津市泰斯特仪器有限 公司；BCD-254博西华冰箱：博西华家用电器有 限公司；UV-5300PC紫外分光光度计：上海元析仪器有限公司；Q2-901漩涡混合仪：海门市其林贝尔仪器制造有限公司；OPTEC生物显微镜：重 庆奥特光学仪器有限公司；GT10-1台式高速离心 机：北京时代北利离心机有限公司；PHS-3C酸度 计：上海精科仪器公司。

1.2 方法

1.2.1 菌种活化

将L60冻干菌粉接种于灭菌MRS 肉汤培养基中，在37 ℃恒温培养箱中活化3代， 得到3代菌悬液。将3代菌悬液以5%的接种量接入 浓度为14%的复原羊乳培养基中，于37 ℃培养至 凝乳，重复2次后保存于冰箱备用。 1.2.2 发酵羊乳制备 将蛋白酶按0.15%的添加量 加入到发酵培养基中，30 min后将活化后的L60接 种于发酵培养基中，41 ℃恒温培养至凝乳，置于 4 ℃冰箱冷藏备用。

1.2.3 待测乳清样品制备

取一定量发酵羊乳于 100 mL烧杯中，测定其pH值。用浓度为1 mol/L HCl溶液调节发酵乳pH至3.4～3.6，8000 r/min离 心15 min并取其上清液；再用1 mol/L NaOH溶液 调节发酵乳pH至8.3，8000 r/min离心15 min，收集 上清液作为待测样品。

1.2.4 OD值的测定

取1 mL发酵乳于50 mL烧杯 中，加入9 mL EDTA(0.2%)溶液，调节pH至12左 右，混匀，静止5 min，以灭菌乳作为空白调零， 在640 nm波长下测定吸光度值。

1.2.5 pH值的测定

测量前对PHS-3C酸度计进行 标定，然后取一定量发酵乳于100 mL烧杯中，使 用酸度计进行测定。

1.2.6 酸度的测定

使用氢氧化钠滴定法，酸 度值用吉尔涅尔度(°T)表示。取5 mL发酵乳加入 到100 mL锥形瓶中，然后加入10 mL蒸馏水，并 滴加2～3滴酒精酚酞指示剂，混匀。用0.1 mol/L NaOH标准溶液进行滴定，不断摇动，当溶液中产 生微红色并且在30 s内不变色时，结束滴定。记录 消耗的NaOH标准溶液的毫升数(V)，乘以20即得 到100 mL发酵液的滴定酸度。

1.2.7 肽含量的测定

利用课题组前期绘制的肽标 准曲线进行测定。 取2.5 mL待测乳清样液，加入2.5 mL 10%(w/ v)的TCA水溶液，混匀，静置10 min，4000 r/min 离心15 min。收集上清液置于50 mL容量瓶中，以 5%的TCA溶液定容，然后取6.0 mL上述溶液于烧 杯中，加入4.0 mL双缩脉充分混合，静置10 min，2000 r/min离心10 min。收集上清液于540 nm下测 定吸光度，代入关系式，计算出肽浓度。

1.2.8 DPPH自由基清除率测定

将DPPH溶于95% 无水乙醇，配制0.l mmol/L DPPH自由基溶液。 将2 mL待测乳清样品与8 mL DPPH自由基溶液混 匀作为试验组，2 mL乙醇溶液与8 mL DPPH自由 基溶液混匀作为对照组，2 mL待测乳清样品与 8 mL乙醇溶液混匀作为空白组。

2 结果与讨论

将单一蛋白酶(木瓜蛋白酶、Alcalase、风味 蛋白酶)和复合蛋白酶(Alcalase和木瓜蛋白酶， Alcalase和风味蛋白酶，Alcalase、风味蛋白酶和 木瓜蛋白酶)分别按0.15%的添加量(复合酶等比例 添加)加入到于90 ℃灭菌后的发酵培养基中，酶解 30 min，然后按5%接种量接入L60，于41 ℃下开 始发酵，分别测定发酵0、4、8、12 h的pH值和滴 定酸度。将单一蛋白酶和复合蛋白酶分别按0.15%的添 加量添加到灭菌后的羊乳中，酶解30 min，然后 接入L60发酵，每隔4 h取样测定其DPPH自由基清 除率，结果如图5所示。由图5可以看出，DPPH自 由基清除率并没有表现出一定的规律性，4 h处添 加蛋白酶的发酵羊乳DPPH自由基清除率已有超过 对照组的，最大组为P+A组，DPPH自由基清除率 为71.1%，此时对照组为48.69%，说明可以通过 添加蛋白酶来缩短生产抗氧化肽的时间。8 h处， 除去A组，其他各组的DPPH清除率都有下降，可 能是由于菌体内的肽酶使抗氧化肽进一步水解。

3 结论

蛋白酶的添加，使发酵羊乳表现出了更高 的肽含量，这得益于蛋白酶较高的水解活性。 另外，添加蛋白酶显著提高了植物乳杆菌L60发 酵羊乳的DPPH自由基清除率。DPPH自由基清 除率最大的是添加单一蛋白酶(木瓜蛋白酶)，为 75.29%，对照组为70.02%。以上结果表明，添加 蛋白酶提高发酵脱脂羊乳的DPPH自由基清除率是 可行的，这将有助于生产具有高抗氧化性的功能 性发酵羊乳饮料。