串联质谱法测定蛋白胨中9种B族维生素

维生素是维持人和动物正常生理功能不可或缺 的一类微量有机物质，在人体生长、代谢、发育过程 中发挥着重要作用。人体必需维生素可分为两类：水溶性维生素和脂溶性维生素，其中水溶性维生 素中又以 Ｂ 族维生素最为重要，Ｂ 族维生素主 要包括硫胺素（ＶＢ1）、核黄素（ＶＢ2）、烟酰胺、烟酸ＶＢ3）、泛酸（ＶＢ5）、吡哆素（ＶＢ6）、生物素（ＶＢ7）、 叶酸（ＶＢ9）和钴胺素（ＶＢ12）等。蛋白胨是一种 利用蛋白质酶解得到的水溶性混合物。作为微生物 培养基的基础成分，蛋白胨可以提供大部分微生物 生长、发育、繁衍所需要的营养氮源。

1 实验部分

1．1 仪器与试剂

Ｕｌｔｉｍａｔｅ 3000 超高效液相色谱仪、ＴＳＱ Ｅｎｄｕｒａ 三重四极杆质谱仪（美国 Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ 公司）；旋涡混合器VORTEX-5（海门市其林贝尔）；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ 万分之一电 子天平（北京赛多利斯公司）。 甲醇、甲酸铵均为色谱纯（德国 ＣＮＷ 公司）；甲 酸为色谱纯（天津市福晨化学试剂厂）。维生素 Ｂ2 （纯度 98. 2％）、维生素 Ｂ6（纯度 100. 0％）、维生素 Ｂ12（纯度 90. 5％）、烟酸（纯度 99. 8％）、烟酰胺（纯 度 99. 9％）均购自中国食品药品检定研究院；维生 素 Ｂ1（纯度 95. 2％）、泛酸（纯度 96. 5％）、叶酸（纯度 91. 3％）、生 物 素 （纯 度 99. 0％）均 购 自 德 国 Ｄｒ． Ｅｈｒｅｎｓｔｏｒｆｅｒ公司。实验用水由 Ｍｉｌｌｉ－Ｑ 系统（美国 Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ 公司）制得。 准确称取适量标准品，维生素 Ｂ1、维生素 Ｂ2 和 生物素用甲酸溶解后用甲醇定容，其他标准品均用 甲醇溶解并定容，均置于 100 ｍＬ 棕色容量瓶中，配 制标准储备液。移取各标准储备液，用甲醇稀释成 质量浓度为 50 ｍｇ ／ Ｌ 的混合标准中间液，于－18 ℃ 避光保存。根据需要用水逐级稀释，配制成适当质 量浓度的混合标准溶液，现用现配。

1．2 样品前处理

称取 0. 2 ｇ（精确至 0. 000 1 ｇ）样品，置于 50ｍＬ 离心管中，加入 10 ｍＬ 水，振荡提取 10 ｍｉｎ，经 0. 22 μｍ 滤膜过滤后，供超高效液相色谱－串联质谱 仪分析。以上操作均避光进行。

1．3 液相色谱与质谱条件

1．3．1 色谱条件

色谱柱：Ｓｙｎｃｒｏｎｉｓ Ｃ18 色谱柱（100 ｍｍ × 2. 1 ｍｍ，1. 7 μｍ，美国 Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ 公司）；柱温：25 ℃；样品室温度：10 ℃；流速：0. 30 ｍＬ ／ ｍｉｎ；流动相 Ａ：0. 1％ （ｖ ／ ｖ）甲酸水溶液；流动相 Ｂ：0. 1％ （ｖ ／ ｖ） 甲酸甲醇溶液。梯度洗脱程序：0～2. 0 ｍｉｎ，90％ Ａ； 2. 0～3. 0 ｍｉｎ，90％ Ａ～ 45％ Ａ；3. 0 ～ 3. 5 ｍｉｎ，45％ Ａ～10％ Ａ；3. 5～4. 0 ｍｉｎ，10％ Ａ～ 90％ Ａ；4. 0 ～ 8. 0 ｍｉｎ，90％ Ａ。进样量：2 μＬ。

1．3．2 质谱条件

离子源：ＥＳＩ 源；扫描方式：正离子扫描；检测方 式：多反应监测（ＭＲＭ）模式；离子源温度：370 ℃； 离子传输管温度：370 ℃；离子喷雾电压：4 000 Ｖ； 鞘气流速：1. 7 Ｌ ／ ｍｉｎ；辅助气流速：0. 7 Ｌ ／ ｍｉｎ；碰撞 气：氩气。ＭＲＭ 监测离子对、化合物保留时间和碰 撞能量（ＣＥ）等参数见表 1。


2 结果与讨论

质谱应用技术中，流动相的选择除考虑色谱的分离效果外还要考虑化合物的离子化程度，由于本 实验选用电喷雾电离源、正离子模式，所以在流动相 中添加了甲酸。此外，有机相分别采用甲醇和乙腈 进行优化，分析各种维生素的响应强度，最终采用甲 醇作为流动相中的有机相。为了确定本实验的 ＭＲＭ 条件，依次将单一标 准品溶液（1. 0 ｍｇ ／ Ｌ）不经过色谱柱直接泵入质谱 中，在 ＥＳＩ－ 模式下，大部分维生素响应较低；在 ＥＳＩ＋ 模式下，9 种 Ｂ 族维生素均能获得丰度较高的母离 子，其中盐酸盐、钙盐等都会脱去盐后以单一分子的 状态离子化，得到［Ｍ＋Ｈ］＋ 峰，维生素 Ｂ12则为多电 子物质，满足［Ｍ＋Ｈ］＋ ／ ｎ 规律。确定母离子后，分 别对其子离子进行二级质谱扫描，选择丰度较高、干 扰较小的两对子离子作为定性离子，丰度最高的离 子作为定量离子，然后优化其碰撞能量。用 0. 1％ （ｖ ／ ｖ）甲酸水溶液配制标准溶液，以各 Ｂ 族维生素的峰面积为纵坐标（ｙ）、质量浓度为横 坐标（ｘ，μｇ ／ Ｌ）绘制标准曲线。结果表明，9 种维 生素均具有良好的线性关系，相关系数（Ｒ2 ）均大于 0. 999。以信噪比为 3 和 10 时的进样浓度为最低检 出含量和最低定量含量，根据样品前处理过程，最终 计算得出该方法的检出限为 0. 09～1. 67 μｇ ／ Ｌ。

3 结论

本实验建立了同时测定蛋白胨中 9 种 Ｂ 族维 生素的超高效液相色谱－串联质谱法，对比 Ｂ 族维生 素测定的相关国家标准，本方法不需要使用繁琐的 微生物法或是高效液相色谱－荧光／ 紫外检测法，简 化了前处理步骤，降低了检测成本，提高了检测效 率。该法简便、快速、准确、灵敏，经方法学验证，所 建立方法具有良好的准确度、精密度与重复性，可为 蛋白胨中 Ｂ 族维生素种类和含量的测定提供技术 支持，并为蛋白胨质量提高及标准化生产提供参考。