其林贝尔研究大鼠学习记忆能力及蛋白质组的影

阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）是一种 神经退行性疾病，以记忆障碍、失用、失认、视空间 损害、执行功能障碍及人格、行为异常为主要临床表 现，主要病理表现包括脑萎缩、β-淀粉样蛋白 （beta-amyloid protein，Aβ）沉积、神经原纤维缠结、 神经元及突触丢失。2000－2013 年，AD 死亡人数 增加 71%，目前全球已有 4680 万人患有 AD，预计 到 2050 年将增加到 1.315 亿，AD 防治的全球成本 已占全球 GDP 的 0.65%。

1 实验材料

1.1 动物

雄性 SPF 级 SD 大鼠 72 只，4 月龄，体质量 250～ 300 g，中国食品药品检定研究院提供，动物许可证号SCXK（京）2014-0013。饲养于北京中医药大学东方 医院实验动物中心 SPF 级动物实验室，温度 （24±2）℃，相对湿度（50±10）%，自由摄食饮 水，12 h/12 h 明暗交替。实验程序根据 NIH《实验动 物的护理和使用指南》进行，该程序经北京中医药大学东方医院动物护理和使用委员会审查批准。

1.2 药物

天芪益智颗粒，北京中医药大学药学院，批号 20140913；石杉碱甲片，河南太龙药业有限公司，批 号 140910A。

1.3 主要试剂与仪器

Aβ1-42（美国 Sigma-Aldrich），TMT sixplex Label Reagent Set（美国 Thermo Scientific Pierce），兔抗 Mdh2（Cell Signaling Technology，#8610），兔抗 Fadd （Abcam，ab124812），小鼠抗 β-actin（Santa Cruz， sc-47778），山羊抗小鼠 IgG-HRP（Santa Cruz， sc-2302），山羊抗兔 IgG-HRP（Santa Cruz，sc-2004）， RIPA 裂解液（Roche Diagnostics），ECL 试剂盒 （Amersham Pharmacia Biotech）。Morris 水迷宫实验 系统（中国医学科学院药物研究所，DMS-2），涡旋振荡器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司），酶标 仪（Thermo，Multiskan MK3），RIGOL L-3000 高效 液相色谱系统（北京普源精电科技有限公司）， GeneGnomeXRQ 生物成像系统（Syngene），高效液 相色谱仪（Thermo Scientic EASY-nLC 1000 System， Nano HPLC），质谱系统（Thermo，Q-Exactive）。

2 实验方法

2.1 分组

将实验大鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组、阳性药组和天芪益智颗粒高、中、低剂量组，每 组 12 只。

2.2 造模

采用 Aβ1-42 微量注射法建立 AD 大鼠模型。操作步骤：将 Aβ1-42 溶解在六氟异丙 醇中至终浓度 4 μg/μL，4 ℃孵育 48 h 形成 Aβ1-42 寡聚体。大鼠腹腔注射 1%戊巴比妥钠（40 mg/kg） 麻醉，使用立体定向仪固定头部，对手术区域消毒， 在颅骨中部纵向切口以暴露颅骨。分离骨膜后暴露头 骨，于前囟后 3 mm、中线旁开 2.2 mm 处，用牙科钻 打开颅骨，使用微量进样器垂直进针 3 mm，将 Aβ1-42 寡聚体溶液缓慢注入两侧海马，注射时间 5 min，留 针 5 min。假手术组注射等体积无菌生理盐水。

2.3 给药

造模后 6 d 开始给药，天芪益智颗粒高、中、低 剂量组分别给予 0.76、0.38、0.19 g/kg 天芪益智颗粒 药液灌胃，阳性药组给予 0.02 mg/kg 石杉碱甲灌胃， 假手术组和模型组给予等量无菌生理盐水灌胃。给药 体积均为 0.5 mL/100 g，每日 1 次，连续 40 d。

2.4 Morris 水迷宫实验

采用 Morris 水迷宫实验评价各组大鼠空间学习 和记忆能力。水迷宫由圆形水池、可移动平台和图像 采集分析系统组成。实验前 1 d，将大鼠置于平台 30 s 后使其入水，自由游泳 60 s 后，将其再次置于平台 30 s。首先进行可视平台测试，平台位于目标象限并 使其顶部高于水面 2 cm，记录大鼠找到平台的逃避潜 伏期和总路程。定位巡航实验：目标象限为第一象限， 平台位于水面下 2 cm，实验连续 5 d，大鼠从除目标 象限外的任一点入水，测定大鼠找到平台的逃避潜伏 期。空间探索实验：撤去平台，将大鼠从除目标象限 外的任一象限入水，测定大鼠穿越目标象限的次数， 记录其在目标象限的停留时间。

2.5 TMT 蛋白质组学分析

2.5.1 样品蛋白提取及胰酶酶解

水迷宫实验结束后，模型组和天芪益智颗粒高剂 量组大鼠腹腔注射 10%水合氯醛（4 mL/kg）麻醉并 处死，冰上快速分离脑组织，用预冷的生理盐水冲洗 干净。每组分别随机选取 3 只大鼠脑组织，将皮层 和海马组织样本中加入适量裂解液（8 mol/L 尿素， 100 mmol/L Tris，1×蛋白酶抑制剂，pH 8.5）中，涡 旋混匀，超声破碎 5 min，使蛋白完全溶解，蛋白悬 浮液 4 ℃、15 000×g 离心 10 min，取上清分装后冻 存于-80 ℃冰箱。采用 Bradford 法测定蛋白溶液的蛋 白浓度。使用胰蛋白酶进行蛋白酶切，将酶切样品溶液加入脱盐柱中进行脱盐处理。

2.5.2 TMT 标记

各组蛋白样品脱盐后，使用 TMT 标记试剂盒进 行标记。标记的样品是大鼠的脑组织，从每组中随机 选择 3 只大鼠进行生物学复制，将所有大鼠脑组织样 品混合，用作重复实验的内标。将 TEAB 缓冲液、TMT 标签和干粉状态下的样品从-20 ℃转移至室温下平 衡。制备 100 mmol/L TEAB 溶液。将单个样品（不超 过 100 μg/TMT 标签）溶于 TEAB 缓冲液，充分混匀， 放置 10 min。每个 TMT 试剂瓶中加入不高于 100 μL 蛋白样品溶液，涡旋振荡，孵育 1 h，向每个瓶中加 入 5%羟胺 8 μL 终止反应，孵育 15 min。标记结束后， 立即将蛋白样品真空冻干，-80 ℃冰箱保存备用。

2.5.3 肽段混合及 LC-MS/MS 检测

将混合标记后的样品用 100 μL 乙腈流动相溶液 溶解，14 000×g 离心 20 min，取上清液，在高 pH 条 件下进行反相色谱梯度分离。将分离得到的组分用 2%乙腈＋0.1%甲酸20 μL复溶。12 000×g离心10 min， 吸取上清液，采用夹心法上样，上样体积 10 μL。 质谱分析时，喷雾电压为 2.41 kV，毛细管温度 为 25 ℃，离子源为 EASY-喷雾源，一级全扫扫描范 围为 350～1600 m/z，分辨率为 70 000 FWHM，扫描 时间为 60 ms，二级图谱扫描范围为 350～1600 m/z， 分辨率为 17 500 FWHM，扫描时间为 70 ms。

2.5.4 质谱数据分析

质谱分析由 Thermo Q-Exactive 型质谱系统完成， 产生的质谱原始文件采用 Thermo 公司的配套软件 Proteome Discoverer 进行处理。数据库的选择以所需 物种、数据库注释完备性及序列可靠性为参考依据， 使用 UNIPROT Rat 数据库，静态修饰选择甲酰胺甲 基化修饰，动态修饰选择氧化修饰。对组间原始数据 的 ratio 进行过滤后，进行 t 检验，确定差异表达的蛋 白质，进行下一步分析。

3 统计学方法

采用 SPSS19.0 统计软件进行分析。实验数据以x±s 表示，Morris 水迷宫实验中定位巡航实验结果使 用双因素重复测量方差分析，空间探索实验结果使用 方差分析比较组间差异；蛋白质定量分析使用 Student's t 检验进行组间差异分析。P＜0.05 表示差异 有统计学意义。

4 结果

4.1 天芪益智颗粒对 Morris 水迷宫实验模型大鼠学习记忆能力的影响

定位巡航实验：随训练时间的延长，各组大鼠逃 避潜伏期均缩短。第 3～5 日，与假手术组比较，模 型组大鼠逃避潜伏期显著延长，差异有统计学意义 （P＜0.01）；与模型组比较，阳性药组和天芪益智颗 粒高、中、低剂量组大鼠逃避潜伏期缩短，部分时点 差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。空间 探索实验：与假手术组比较，模型组大鼠在目标象限 停留时间百分比和穿越目标象限次数明显减少，差异 有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组比较， 阳性药组和天芪益智颗粒高、中剂量组大鼠在目标象 限停留时间百分比和穿越目标象限次数均显著增加， 差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。

4.2 蛋白质组差异蛋白鉴定结果

经 LC-MS/MS 检测分析、蛋白数据库检索及组间 差异比较，成功鉴定出 33 个天芪益智颗粒高剂量组 与模型组差异蛋白质。这些差异蛋白的功能与能量代谢、神经信号传递、神经营养、细胞凋亡、 蛋白质运输、细胞骨架等脑神经细胞生理、病理过程 密切相关，其细胞定位包括线粒体、细胞膜、细胞质、 细胞核、髓鞘、细胞骨架、内质网等部位。

4.3 差异蛋白 GO 功能分类结果

GO 分类结果显示，这些差异蛋白分子功能涉及 蛋白结合活性、催化活性、受体活性、信号传导活性、 结构分子活性、转运活性；生物学过程涉 及生物调节、生物合成、细胞过程、发育过程、细胞 定位、代谢过程、应激反应等；细胞组分 包括大分子复合物、细胞膜、细胞器等； 信号通路涉及 ATP 合成、凋亡信号通路、RhoGTP 酶 对细胞骨架的调控、Fas 信号通路、谷氨酰胺-谷氨 酸转化通路、糖酵解、三羧酸循环信号通路等。

5 讨论

红景天 药，具有较 一种苯丙素 毒性、抑制 糖具有明显 反应等药理 芪益智颗粒 用；TMT 蛋 能调节 AD 水平；West 和 Fadd 的致。