小儿呼吸道合胞病毒(RSV)的效果观察旋涡混合器

急性呼吸道感染是小儿时期的常见疾病，临 床数据统计显示95%以上的小儿急性呼吸道感 染是由病毒导致的，而呼吸道合胞病毒(RSV)就是 引发急性呼吸道感染的常见病毒之一。RSV感染 主要是由于眼、口、鼻等部位的黏膜接触导致的， 其中婴幼儿感染率更高。随着病情的发展，小 儿RSV感染除了上呼吸道感染，还可能导致肺炎、 支气管炎等下呼吸道感染。不同种类病原体的 呼吸道感染的治疗方法不同，有效的病原体检测 分类能为临床的准确治疗提供参考依据。病毒 分离培养是检测RSV感染的金标准，但是操作繁 琐耗时，需要10 d左右才能得到检测结果，且检测 费用高，临床应用受限。

1 对象与方法

1.1 一般资料

选取2017年1月至2019年1月我 院儿科收治的175例呼吸道感染患 儿作为 研究 对象，其中男103例，女72例，年龄0.3～10岁，平均 年 龄 (4.7 ±1.3)岁 ，病 程 4 d ～2 个 月 ，平 均 病 程 (1.3±0.4)个月，其中急性支气管肺炎67例，毛细 支气管炎71例，小儿哮喘37例。

1.2 方法

采用痰液收集器收集所有患儿的鼻 咽吸出物，存贮于储液器内，使用Hank液进行吹 打混匀后，以1 000 r/min的速度离心5 min，吸取上 清液，并保存在－80 ℃环境下备用待检。所有受 检的患儿均分别采用免疫荧光技术和荧光探针 PCR技术检测患儿RSV感染的情况，并以病毒培养 法进行明确诊断。

1.2.1 免疫荧光技术检测

吸取500 μL的鼻咽 吸出物样本，加入5～8 mL的磷酸缓冲盐溶液， 先置入旋涡混合器（旋涡混合器VORTEX-5）震荡3～5 min进行混合均匀， 再以300～500 r/min的离心速度离心10 min。去除 上清液后，收集下面的沉淀物再次加入5～8 mL 的磷酸缓冲盐溶液并重复震荡和离心的操作。再 次收集沉淀物后加入一定的磷酸缓冲盐溶液调成 1.0×106 的细胞悬液。吸收25 μL的细胞悬液加入8孔载玻片中，37 ℃条件下待其干燥后使用冷丙 酮固定10 min。接着在玻片上滴加荧光抗体染色， 室温下进行孵育0.5 h。然后采用磷酸盐吐温缓冲 液连续冲洗3次玻片后再采用蒸馏水进行冲洗，去 除多余的冲洗液，最后待玻片彻底干燥后在每个 细胞点上加上1滴封片剂进行封片。在德国蔡司公 司的AXIOVERT 40型荧光显微镜下观察载玻片上 细胞点内的荧光情况。以出现荧光苹果绿视为 PSV感染阳性，否则视为阴性。

1. 2. 2 免 疫 探 针 PCR 技 术 检 测

吸 取 150 μL 的 鼻 咽 吸 出 物 样 本 ，选 用 德 国 Qiagen 公 司 的 QIAmpRNA Mini Kit病毒RNA提取试剂盒按照其 说明书进行提取样本中的病毒RNA。根据探针设 计原则选择的引物为，上游：RSV- F：5'- GGA CAA GTT G TT GAG GTT TAT GAA TAT GC- 3'，下游： RSV- R：5'- T TC TGC TGT CAA GTC TAG TACACT GTA GT- 3'。采用随机合成的引物将提取到的RNA 合成cDNA，选用美国ABI公司的7500型荧光PCR 仪放入反应管进行PCR扩增反应，设置的反应条 件为：①42 ℃，8 min预变性。②94 ℃，30 s，55 ℃， 30 s，72 ℃，45 s，35个循环。荧光素设定FAM，反 应结束后通过扩增Ct值判断结果。

1.3 观察指标

统计免疫荧光技术和荧光探针 PCR技术进行检测患儿RSV感染的情况，以病毒培 养法的RSV感染结果作为诊断的金标准，比较免 疫荧光技术和荧光探针PCR技术检测诊断患儿RSV感染的灵敏度、特异度以及准确性等诊断效 能。灵敏度＝真阳性人数/(真阳性人数＋假阴性 人数)×100%。特异度＝真阴性人数/ (真阴性人 数＋假阳性人数) ×100%。准确性＝(真阴性人 数＋真阳性人数)/(真阴性人数＋假阴性人数＋真 阳性人数＋假阳性人数)×100%。

1.4 统计学处理

应用SPSS 19.0统计学软件进 行数据的统计学分析，诊断效能等计数资料采用 率表示，组间差异采用卡方检验，P＜0.05为差异 有统计学意义。

2 结果

2.1 两种检测方法诊断RSV感染的结果比较

(表1) 175例呼吸道感染患儿中RSV感染阳性103例，其 中男64例，占比62.14%，女39例，占比37.86%。免 疫荧光技术检测诊断患儿RSV感染阳性98例，其 中真阳性88例，荧光探针PCR技术检测诊断患儿 RSV感染阳性104例，其中真阳性102例。

2.2 两种检测方法诊断RSV感染的诊断效能比较

(表2) 免疫荧光技术检测诊断患儿RSV感染的 灵 敏 度 、 特 异 度 以 及 准 确 性 分 别 为 85.44% 、 86.11%、85.71%。荧光探针PCR技术检测诊断的 灵 敏 度 、特 异 度 以 及 准 确 性 分 别 为 99.03% 、 97.22%、98.29%，两者相比荧光探针PCR技术检 测诊断患儿RSV感染的各项诊断效能均优于免 疫荧光技术检测，差异有统计学意义(P＜0.05)。




3 讨论

数据统计，目前国内每年死于急性呼吸道感 染的患儿约有10万，其中在部分经济发展较为滞 后的省市急性呼吸道感染患儿的病死率更高，严 重影响儿童的身体健康和生命安全。根据感染病原体的不同，主要分为细菌感染和病毒感染，以 后者的占比更大，高达90%。其中RSV是导致儿童 急性呼吸道感染的常见病原体，也是目前全球范 围内公认的诱发儿童急性肺炎和毛细支气管炎的 最为主要的病原体。在发生RSV呼吸道感染时，缺乏特异性的临床症状及表现，依靠其进行鉴别 诊断的难度较高。



 

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