临床稀有血型孕妇RHD基因分型研究

在RhD（-）血液样本中存 在20%左右的Del型，其具有完整的RHD基因，Del型 个体在接受D抗原致敏后不会产生同种不规则抗-D抗 体。当个体按血清学标准诊断时，需要按RhD（-） 者频繁进行抗- D检 测，甚至还要输注R h免疫球蛋 白。而对于RhD（-）孕妇来说，这无疑增加了其心 理、经济负担。因此，对RhD（-）孕妇进行基因分型，可以更准确的判断其Del表型，为临床检测、诊 断及输注提供更有效的保证。本文主要收集广州番禺 城区范围内的RhD（-）孕妇样本进行血清学和基因 分型研究，从分子水平分析RhD（-）的各种表型， 补 充RHD基因检测本地数据库，以期指导临床孕妇 RhD（-）检测、准确鉴定Del分型，减少RhD（-）孕 妇不必要的频繁的抗-D效价检测和Rh免疫球蛋白预 防性输注。

资料与方法

1研究对象

收集2015年1月~2017年12月的本地区医 院孕妇初筛RhD阴性18例血标本，年龄22~40岁，平 均年龄31岁。用EDTA-K2抗凝试管留取2~5mL全血。

2 试剂与设备

2.1 试 剂

IgG+IgM型 抗- D（法 国DIAGAST公 司 生 产，批 号BMJ 1204D）；IgM型单克隆抗- D试 剂 （德国Biotest公司生产，批号1029060）；IgG型单克隆抗- D试 剂（上海血液生物医药有限责任公司， 批号20151224）。血基因组DNA提取试剂盒（天津 秀鹏生物技术开发有限公司，批 号201708010）； R H基因变异体基因分型检测试剂盒（天津秀鹏生 物技术开发有限公司，批 号201708010）；电泳缓 冲液（1×TBE天津秀鹏生物技术开发有限公司, 批 号201708011）；琼脂糖（北京康为世纪公司, 批号 06910K）。

2.2 设备

低速离心机（北京医用离心机厂），高速 离心机（北京白洋离心机厂），水浴箱（上海博讯公司），涡旋振荡器（其林贝尔公司），9700型PCR扩 增仪（美国ABI公司），电泳仪（北京六一仪器厂）, 水平电泳槽（北京六一仪器厂），凝胶成像系统（珠 海黑马公司）。

3 检测方法

3.1 血清学方法

RhD（-）确认（试管法）：取三个 不同厂家IgG或IgG+IgM性质的抗-D试剂100μL，分 别与受检者5%红悬液5 0uL混匀，O型RhD阴、阳性 红细胞作为对照管，于37℃温水中孵育1h，然后以生 理盐水洗涤3次，去除上层清液，每管加入100μL抗 人球蛋白试剂，离心机离心6 0s，速度1 000r/min。 结果判定：检测管出现凝集现象则为阳性，反之为 阴性。需3种抗-D试剂均检测为阴性才能确定样本为 RhD（-）。Del表型鉴定：对确认为 RhD（-）的标 本，另外再取红细胞标本以IgG抗-D进行吸收，并采 用酸放散试验，当吸收放散试验结果阳性时表明标本为Del表型。

3.2 血型基因组DNA提取

使用高速离心机、水浴 箱、涡旋振荡器等设备，严格按照天津秀鹏生物技术 开发有限公司生产的全血基因组DNA提取试剂盒说明 书操作，对抗-D筛查阴性的样本提取基因组DNA备 用。

3.3 基因分型

根据RH基因变异体基因分型检测试 剂盒，在扩增仪上进行基因分型试验。将将100μL dNTP-Buffer浓缩液、140μL去离子水 、2.0μL Taq 酶（5units/μL）和 2 5μL样本DNA共267μL混合 液；向每个引物孔（1~24孔）各加入10μL上述混合 液。扩增循环参数：96℃ 2 min ，1 cycle ；96℃20 S/68℃60S ，5 cycles； 96℃20 S/65℃50S /72℃45 S，1 0 cycles；9 6℃2 0 S / 6 2℃5 0 S / 7 2℃4 5 S，2 5 cycles； 72℃2min，1 cycle。吸取5μL扩增产物， 加入配制好的2%琼脂糖凝胶中并进行电泳，电泳参 数设置为电压100V，时间15min。电泳后用凝胶成像 仪进行拍照、记录与分析。基因分型的结果判断见表 1。

结 果

1 RhD（-）确认及DeL表型检测 用含有IgG型抗-D 检测红细胞标本时，18例初筛RhD（-）标本中， 18 例标本均确定为血清学RhD（-），吸收放散试验 中确定4例DeL表现型（占2 2 .2%），其 中3例CCee （16.7%）、1例ccEE（5.6%）。具体见表2。



讨 论

RhD（-）个体可能产生抗-D，该抗体可引发严 重的HDN甚至胎儿死亡。因此对于孕期妇女来说，为 了尽量避免胎儿宫内及新生儿溶血的发生，需要密切 监测孕妇体内抗-D，必要时需输注Rh免疫球蛋白进 行阻断。临床上通过血清学检测的RhD（-），可能 部分个体并非外显子全缺失，而是由于部分缺失或某 个碱基变异导致。目前国内常见的RHD基因分型 主要有放散D(DEL）、部分D与弱D等变异型，DEL 型作为国内外较常见的RHD变异型，其分子机制已被 报道。DEL的RHD变异型基因在第9处外显子有一处 末位碱基突变，促使RNA转录时内含子被错误剪切，导致无法正常表达RHD蛋白。



 

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