阴道分泌物微生物组学分析(其林贝尔QL901使用)

女性不孕不育、习惯性流产、早产、死 胎、宫颈炎和阴道炎等泌尿生殖系统疾病一直困扰着许多 患者，其 中 许 多 疾 病 病 因 不 明，致 病 机 制 不 清 楚。 女性阴道微生态体系是由阴道内的微生物菌群、机 体的内分泌调节功能和解剖结构共同组成。正常 女性阴道内存在大量常居菌群和少量条件致病菌，当菌群结构失调时，就会改变阴道内的微生态平衡， 导致各种疾病的发生。

１ 对象与方法

１．１ 研究对象

经深圳市第七人民医院伦理委员会 通过和深圳市盐田区卫健委批准２０１６０２０２立项，选 择２０１７－２０１８年在深圳市第七人民医院妇产科门诊 产检妊娠妇女２０名，深圳市福田区妇幼保健院妇保 科健康查体未婚无性生活女性２９名。４９名 研 究 对 象阴道分泌物常规检查均正常。

１．２ 标本采集

研究对象排空膀胱内尿液后，严格 无菌操作 采 集 阴 道 内 分 泌 物。所 有 样 本 均 －２０ ℃ 保存。

１．３ 仪器设备及试剂

Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ仪器、５４２７Ｒ 型低温离心机购于 Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司，ＱＬ９０１型漩涡振荡器购于海门其林贝尔，ＤＮＡ 提取试剂盒购于中 山大学 达 安 基 因 有 限 公 司，ＩｌｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑ２５００ 测 序仪 购 于 美 国 Ｉｌｌｕｍｉｎａ 公 司，１６ＳｒＤＮＡ 基 因 和 ＩＴＳ序列试剂盒购于华大基因有限公司。

１．４ 样本 ＤＮＡ 提取

标本用１ｍＬ 生理盐水充分 震荡洗脱后１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，弃上清后在 沉淀物中加入 ＤＮＡ 提取液５０μＬ，然后１００℃裂解 １０ｍｉｎ，再１２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，上清液中样本 ＤＮＡ 模板保存－２０ ℃冰箱备用。

１．５ 文库构建及测序

设计合成含有测序接头的双 Ｉｎｄｅｘ融合引物 （Ｖ４区大约１２０ｂｐ，ＩＴＳ１区１３０～ １５０ ｂｐ。 Ｖ４ Ｆ： ＧＴＧＣＣＡＧＣＭＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡ， Ｖ４Ｒ：ＧＧＡＣＴＡＣＨＶＧＧＧＴＷＴＣＴＡＡＴ；ＩＴＳ１Ｆ： ＣＴＴＧＧＴＣＡＴＴＴＡＧＡＧＧＡＡＧＴＡＡ，ＩＴＳ１Ｒ：Ｇ－ ＣＴＧＣＧＴＴＣＴＴＣＡＴＣＧＡＴＧＣ），以 检 测 合 格 的 样 本 ＤＮＡ 为模板，扩增样本１６ＳｒＤＮＡ 基因的 Ｖ４区和ＩＴＳ序列的ＩＴＳ１区域，磁珠筛选目的扩增片段， 最后用 合 格 的 文 库 进 行 Ｃｌｕｓｔｅｒ制 备 和 Ｐａｉｒｅｄ－ｅｎｄ 测序。用 下 机 得 到 的 数 据 进 行 相 应 的 生 物 信 息 学 分析。

１．６ 序列拼接及数据处理

Ｉｌｌｕｍｉｎａ平台下机数据 经过数据过滤，滤除低质量的ｒｅａｄｓ，剩余高质量的 Ｃｌｅａｎｄａｔａ方可用于后期分析；利用 Ｏｖｅｒｌａｐ关系， 使用 ＦＬＡＳＨ （ｖ１．２．１１）软件将双末端测序得到的 成对ｒｅａｄｓ组装成一条序列，得 到 高 变 区 的 Ｔａｇｓ， 拼接条件为最小匹配长度１５ｂｐ和重叠 区 域 允 许 错 配率为１０％，去除没有ｏｖｅｒｌａｐ关系的ｒｅａｄｓ；利用 ＵＳＥＡＲＣＨ （ｖ７．０．１０９０）软件将拼 接 好 的 Ｔａｇｓ聚 类成 ＯＴＵ，其主要过程包括利用 ＵＰＡＲＳＥ 软件在 ９７％的相似度下将 Ｔａｇｓ聚成 ＯＴＵ 的代表序列和利 用 ＵＣＨＩＭＥ （ｖ４．２．４０）软件将 ＰＣＲ扩增产生的嵌 合体从 ＯＴＵ 代表序列中去除；然后通过 ＲＤＰｃｌａｓ－ ｓｉｆｅｒ （ｖ２．２）软 件 将 ＯＴＵ 代 表 序 列 与 ＧｒｅｅｎＧｅｎｅ 数据库比对，对 ＯＴＵ 进行物种注释；基于 ＯＴＵ 和 物种注释结果进行样品物种复杂度分析以及组间物 种差异分析。

１．７ 统计学处理

采用秩和检验进行组间显著性差 异分析，使用 Ｒ软件 （ｖ３．１．１）进行数据处理。检 验水准α＝０．０５。

２ 结 果

４９份样本物种注释 １６ＳｒＤＮＡ 基因 ＯＴＵ 通 过与 ＧｒｅｅｎＧｅｎｅ 数 据 库 比 对 分 析， 分 别 注 释 出 １３个门、２２ 个 纲、３２ 个 目、２７ 个 科、３７ 个 属 和 ２１个种水平物种 。ＩＴＳ序列 ＯＴＵ 通过 与 ＧｒｅｅｎＧｅｎｅ数据库比对分析，分别注释出１个门、 １个纲、１个目、１个科、１个属和２个种水平物种。２．２ ２９份无性生活女性和２０份妊娠妇女样本物种 注释 １６ＳｒＤＮＡ 基 因 ＯＴＵ 通 过 与 ＧｒｅｅｎＧｅｎｅ数 据库比对分析，２９份无性生活女性样本在种水平共 注释出１９个 物 种，２０份 妊 娠 妇 女 样 本 在 种 水 平 共注释出７个物种。ＩＴＳ序列 ＯＴＵ 通过 与 ＧｒｅｅｎＧｅｎｅ数据库比对分析，无性生活女性样本 和妊娠妇女样本均注释出白假丝酵母菌和近平滑假 丝酵母菌。

３ 讨 论

阴道内广泛定植的微生 物称为阴道微生物群，被公认为参与保护宿主免受 各种细菌、真菌和病毒感染的重要屏障。健 康 人 群体内的微生物菌群处于良好的动态平衡，当平衡 状态被打破时就会诱发或导致某些疾病。绝大多数 微生物群与宿主相互影响和相互制约，形成共生关系，极少数条件致病菌可引起慢性感染。女性阴道 内存在多种微生物菌群，主要寄居于阴道四周的侧 壁黏膜中，共同形成生物膜，对维持阴道微生态的 平衡和预防感染起到了重要作用。菌群失调能引 起细菌性阴道炎，增加早产风险。阴道炎 患 者 阴 道菌群分布既可表现为正常，也可表现为失调状态， 其中混合性阴道炎最容易复发。不同年龄段，不同 季节患者阴道菌群分布不同。



 

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