H7生物菌膜形成的影响（其林贝尔QL-200使用）

近年来，食源性致病菌生物菌膜已成为食品安全领 域中的研究热点。生物菌膜是细菌在生长过程中为适 应生存环境而黏附、生长于组织表面，在菌体-菌体和菌 体-接触面的相互作用下，通过菌体增殖、分泌胞外基质 而形成的具有一定空间结构的细菌聚集体。形成菌膜 后，细菌菌体对外界环境的抵抗力会大大增强，对工业 清洗剂和消毒剂具有更强耐受性，不易清除，残留的生 物菌膜可在环境适宜时脱落出细菌菌体，成为潜在污染 源，进一步造成交叉污染，引发严重的食品安全问题。 大肠杆菌O157:H7是全球范围内备受关注的食源性致病 菌，每年都会爆发多起因大肠杆菌O157:H7污染而引发的 食物中毒事件。有研究表明，大肠杆菌O157:H7在固体表 面（如加工器械表面、畜禽胴体表面等）产生黏附的特 性是其造成交叉污染的主要原因。

1 材料与方法

1.1 菌株、材料与试剂

实验用大肠杆菌O157:H7共1 4 株，包括菌株 CICC21530（购自中国工业微生物菌种保藏中心） 菌株ATCC43895（购自美国菌种保藏中心）、菌株 NCTC12900（购自广东环凯微生物科技有限公司）， 其余11 株为南京师范大学食品与制药工程学院实验室 分离自牛肉和牛粪。胰蛋白胨大豆琼脂（tryptone soya agar，TSA）培 养基、胰蛋白胨大豆肉汤（tryptic soy broth，TSB）、 胰蛋白胨大豆琼脂酵母提取物（tryptone soya agar yeast extract，TSAYE）培养基 北京陆桥技术有限公司； LIVE/DEAD® BacLight Bacterial Viability Kits（L7012） 美国Molecular Probes公司；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、 氯化钠、结晶紫、乳酸、戊二醛、锇酸、乙醇 南京化 学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

M2多功能酶标仪 美国Molecular Devices公 司；SZX超净工作台 上海浦东跃欣仪器厂；LDZX30FBS立式压力蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂； SG403A Sterile GDRD生物安全柜 美国Baker公司； 拍打式均质器 青岛众瑞智能仪器有限公司；生化培 养箱 上海新苗医疗器械制造有限公司；QL-200微型 漩涡混合仪 海门其林贝尔仪器有限公司；2-16KL高 速冷冻离心机 美国Sigma公司；DHP-9052型电热恒 温培养箱 上海一恒科技有限公司；LSM 710 CLSM 德国Carl Zeiss公司。

1.3 方法

1.3.1 菌液制备

冻藏的14 株大肠杆菌O157:H7经TSA平板划线，于 37 ℃培养24 h，挑取单菌落接种至3 mL TSB中，37 ℃ 摇床培养18 h，再吸取1 mL菌液转接至100 mL TSB 中，37 ℃摇床培养18 h，使菌液浓度达到108 CFU/mL 左右。取1 mL培养好的菌液离心（6 000×g、5 min、 4 ℃），弃去上清液，用磷酸盐缓冲液（pH 7.2）洗涤 2 次，重悬后备用。

1.3.2 大肠杆菌O157:H7黏附性能比较

采用微孔板结合结晶紫染色法。取500 μL 备用菌液，接种至一定体积TSB中（菌体浓度约为 2～3（lg（CFU/mL））。吸取180 μL置于96 孔细胞培养 板中，封口膜包被，于25 ℃培养72 h，以不接种细菌的 TSB作为空白对照。培养结束后，弃去微孔中的细菌培 养液，无菌蒸馏水洗涤3 次，室温下干燥45 min后，每孔 加入200 μL 0.25 g/100 mL结晶紫染液染色30 min，弃去 染液并用无菌蒸馏水洗涤3 次，200 µL体积分数95%乙醇 溶液洗脱30 min，最后将微孔板置于酶标仪中在570 nm 波长处测定其OD值。每个菌株重复6 次。

1.3.3 微孔法分析大肠杆菌O157:H7生物菌膜的形成曲线

根据1.3.2节结果，选取生物菌膜形成能力不同的几 株大肠杆菌O157:H7，按1.3.2节方法进行微孔板操作，分别在培养2、4、8、12、16、24、36、48、60、72、 120、168 h取样，以不接种的TSB作为对照组。经结晶 紫染液染色、乙醇洗脱，570 nm波长处测定其OD值，所 得OD值按照培养时间绘制菌膜形成曲线。每个菌株每个 时间点均重复6 次。

1.3.4 酸应激对菌株生物菌膜形成的影响

根据1.3.2节和1.3.3节结果选取代表菌株，研究酸 应激对其生物菌膜形成的影响。用3 mol/L乳酸溶液和 1 mol/L盐酸溶液分别配制系列pH值梯度（pH 3.5、 4.0、4.5、5.0）TSB作为酸性培养液，同时以未经酸处 理的正常TSB作为对照。采用机械脱落平板计数法检 测菌膜形成。 按1.3.1节方法进行菌液制备，取100 μL备用菌液接 种于10 mL载有不锈钢片的上述不同酸度TSB中，菌液 浓度约为106 CFU/mL。将接种好的样品于25 ℃静置培养 2、4、8、12、24、48、72、120、168 h，规定时间取样 后，对培养装置里的浮游菌数和不锈钢表面形成的生物 菌膜进行计数。生物菌膜计数前用无菌生理盐水清洗不 锈钢片3 次以去除钢片表面未黏附的游离菌体，用拍击冲击法采集钢片表面的黏附菌体，将清洗后的载有生物 菌膜的不锈钢片放入装有80 mL无菌生理盐水的均质袋 中，并放入少量无菌棉，在480 击/min条件下拍击60 s， 吸取均质液进行梯度稀释，涂布至TSAYE平板中，37 ℃ 下培养24 h后计数。每组实验重复3 次。

1.3.5 酸应激下不同黏附力菌株生物菌膜的CLSM观察

根据1.3.2节和1.3.3节结果选取黏附力不同的代表 菌株，采用CLSM比较不同pH值时代表菌株生物菌膜 的结构变化。按1.3.1节方法制备菌液，取100 μL备用 菌液接种于10 mL载有不锈钢片的酸性和正常TSB中， 菌液浓度约为106 CFU/mL。将接种好的样品于25 ℃静 置培养，分别在24、72 h和168 h取出，无菌蒸馏水充 分洗涤不锈钢片以去除其上的游离菌体，吸取LIVE/ DEAD® 荧光染液对不锈钢片表面进行染色，室温避光 条件下充分作用15 min后，用无菌蒸馏水充分洗涤不锈 钢片以除去多余荧光染料，室温避光条件下放置自然干 燥，使用CLSM（60×，油镜）观察染色后的生物菌膜 结构。LIVE/DEAD® 为由核酸染料SYTO 9和碘化丙啶 （propidium iodide，PI）复配的荧光染料；其中SYTO 9 激发波长和吸收波长分别为480 nm和500 nm，可以将生 物菌膜中具有完整细胞膜的菌体（活菌）染成绿色，PI 激发波长和吸收波长分别为490 nm和635 nm，可以将生 物菌膜中细胞膜损伤的菌体（死菌）染成红色，从而可 以区别生物菌膜中的活菌和死菌。每组随机选用10 张 CLSM图像，使用NIS-Element Viewer软件和Image J 软件 对图像进行处理。

1.4 数据统计与分析

数据处理应用SPSS 17.0软件，采用单因素方差分析 及Duncan’s多重比较检验进行差异显著性分析。

2 结果与分析

进一步选取中等黏附力菌 株ATCC43895为代表菌株，利用机械脱落平板计数法观 察酸应激下不锈钢表面该菌株生物菌膜的形成。结果表 明，pH 3.5乳酸-TSB的抑菌效应强，该菌株浮游菌数和 生物菌膜形成数量均未达到检测限，而pH 3.5盐酸-TSB 对该菌株浮游菌数和生物菌膜数量影响均较小，故对 pH 3.5乳酸-TSB和pH 4.0、4.5、5.0盐酸-TSB未作进一步 研究。示。培养24 h时可 发现两种培养条件下均开始有少量单个菌体黏附于不锈 钢表面，培养72 h时正常TSB中已有少量小的细菌“团 状物”出现，而pH 5.0乳酸-TSB组中的菌体出现连接趋 势，但未观测到“团状物”出现，培养168 h时正常TSB 中的菌体连接成“网状”结构，而pH 5.0乳酸-TSB组中 的菌体网状结构比较松散，且观察到较多红色菌体，表 明死菌数明显增加。

3 讨 论

食源性致病菌生物菌膜比游离菌体对食品安全的威 胁更大，菌体形成成熟生物菌膜的初始步骤是黏附于接触面，因此本研究首先对14 株大肠杆菌O157:H7黏附 性能进行比较，发现14 株菌株均能在聚苯乙烯微孔表面产生黏附，表明这些大肠杆菌O157:H7都具有形成生物菌 膜的能力，但不同菌株菌膜形成能力存在差异。

4 结 论

生物菌膜是食品加工中微生物交叉污染的源头，本 实验结合食品加工实际环境探究较长时间酸应激对大肠 杆菌O157:H7生物菌膜形成的影响。采用微孔板结合结晶 紫染色法比较14 株大肠杆菌O157:H7黏附性能差异，结 果发现黏附性能存在明显菌株差异。选取较强黏附力菌 株J29，中等黏附力菌株ATCC43895和4 株较弱黏附力菌 株，采用微孔板结合结晶紫染色法观察菌膜形成曲线， 结果表明各菌株均在培养2 h开始产生黏附，但黏附性能 不同的菌株其菌膜形成曲线呈现明显差异。


 

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