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家兔体内的药动学研究(其林贝尔BE-1100使用)

返回列表 来源:未知 发布日期:2019-11-14 10:18【

青风藤碱(Sinoacutine,结构式见图1A)为异喹啉类 生物碱,是从防己科千金藤属云南地不容(Stephania yunnanensis Lo)等多种植物中提取分离而得。研究发 现,青风藤碱具有镇静、镇痛、抗炎、抗心律失常等活 性,例如青风藤碱能明显提高小鼠热板痛阈和足趾电刺 激痛阈,减少醋酸所致的小鼠扭体次数;与戊巴比妥钠 联用后,可增强后者的镇静催眠作用;此外,青风藤碱 还具有抗Ⅱ型胶原蛋白致大鼠类风湿性关节炎的作用, 并可明显降低氯仿致小鼠室颤的发生率 。本课题组 前期研究发现,青风藤碱能明显缩短氯化钡致心律失常 模型大鼠恢复窦性心律所需的时间。

1 材料

1.1 仪器

1260 型 HPLC 仪(美国 Agilent 公司);HSC-12A 型氮吹仪(天津市恒奥科技发展有限公司);TGL-16G型高 速台式离心机(上海安亭科学仪器厂);XK96-A型快速 混匀器(姜堰市新康医疗器械有限公司);BT25S型分析 天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司];SK3300型超 声机(上海科导超声仪器有限公司);其林贝尔BE-1100型四维旋 转混合仪(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)。

1.2 药品与试剂

青风藤碱原料药(纯度:98%)、青风藤碱对照品(纯 度:98%)均为本实验室自制;青藤碱对照品(内标,中国 食品药品检定研究院,批号:110774- 201808,纯度:供鉴 别和含量测定用);甲醇为色谱纯,乙酸乙酯、乙胺等其 余试剂均为分析纯,水为纯化水。

1.3 动物

SPF级健康家兔12只,雌雄各半,10~12周龄,体质 量 2.0~2.5 kg,购自昆明楚商科技有限公司,动物生产 许可证号:SCXK(滇)K2018-0001。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色 谱 柱 :Agilent Zorbax Extend-C18(250 mm × 4.6mm,5 μm);流动相:甲醇-2 mmol/L磷酸氢二钠水溶液 (含 0.016%三乙胺,pH 为 9.8)(45 ∶ 55,V/V);流速: 1 mL/min;检测波长:262 nm;柱温:30 ℃;进样量:20 μL。

2.2 溶液的配制

2.2.1 青风藤碱标准溶液

精密称取青风藤碱对照品 10 mg于10 mL量瓶中,用甲醇溶解并定容,制成质量浓 度为1.0 mg/mL的对照品贮备液。取上述对照品贮备液 适量,用甲醇进一步稀释,制成质量浓度分别为1.0、5.0、 10.0、15.0、25.0、40.0、50.0 mg/L的青风藤碱系列标准溶 液,于-20 ℃下密封保存,备用。

2.2.2 内标溶液

精密称取青藤碱对照品 10 mg 于 10 mL 量瓶中,用甲醇溶解并定容,制成质量浓度为 1.0 mg/mL的内标贮备液。取上述内标贮备液适量,用甲醇 进一步稀释,制成质量浓度为 100.0 mg/L 的内标溶液, 于-20 ℃下密封保存,备用。

2.2.3 青风藤碱药液

精密称取青风藤碱原料药 250 mg 于 50 mL 量瓶中,加入 10%柠檬酸溶液 1 mL,超声 (功率:400 W,频率:40 kHz)溶解,加生理盐水定容,制成质量浓度为5 mg/mL的青风藤碱药液(现配现用)。

2.3 血浆样品的处理

精密吸取血浆样品0.5 mL,加入100.0 mg/L内标溶 液20 μL,涡旋3 min,加入乙酸乙酯3 mL,涡旋3 min,使 用四维旋转混合仪萃取 20 min 后,以 6 000 r/min 离心 10 min;精密吸取上清液2.4 mL,于50 ℃水浴中以氮气 流吹干;残渣加入甲醇 150 μL 复溶,涡旋 3 min 后,以 4 000 r/min离心10 min,取上清液,经0.22 μm微孔滤膜 滤过,取续滤液20 μL,进样分析。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性

取空白血浆、空白血浆+内标(100.0 mg/L)+青风藤碱(50.0 mg/L)、雌性家兔给药后5 min的 血浆样品各适量,按“2.3”项下方法处理(其中,空白血浆 不加内标溶液)后,再按“2.1”项下色谱条件进样测定,记 录色谱图。结果,各待测物的理论板数均大于4 000;内 标与青风藤碱的保留时间分别约为20.8、24.3 min,呈基 线分离,分离度大于 1.5,且血浆内源性物质无干扰,。

2.4.2 线性关系、定量下限及最低检测限考察

精密量 取家兔空白血浆450 μL,分别加入“2.2.1”项下青风藤碱 系列标准溶液各50 μL,得质量浓度分别为0.1、0.5、1.0、 1.5、2.5、4.0、5.0 mg/L的青风藤碱系列血浆样品,按“2.3” 项下方法处理后,再按“2.1”项下色谱条件进样分析,记 录色谱图。以待测物质量浓度(x,mg/L)为横坐标、待测 物与内标的峰面积比值(y)为纵坐标进行线性回归,得 回归方程为 y=0.504 5x-0.072 9(r=0.999 5)。结果, 青风藤碱检测血药浓度的线性范围为0.1~5.0 mg/L,定量下限为0.1 mg/L(信噪比为10 ∶ 1);以信噪比3 ∶ 1测得 最低检测限为0.08 mg/L。


3 讨论

3.1 内标化合物的选择

采用内标法检测了家兔血浆中青风藤碱的 质量浓度。在前期内标化合物的筛选中,笔者以色谱峰 峰形及提取回收率为指标,对克班宁、异克利定、荷叶 碱、光千金藤定碱、青藤碱等5种异喹啉类生物碱进行了 考察。结果显示,上述化合物的提取回收率为 67%~85%,RSD均小于15%,其中以青藤碱的提取回收率最 为稳定且相对较高;此外,青藤碱与青风藤碱的保留时 间虽较为接近,但峰形和分离度均较好,有利于缩短检 测所需时间,故最终选择青藤碱作为内标。

3.2 色谱条件的优化及血浆样品处理方法的筛选

本研究在2015年版《中国药典》(一部)青风藤中青 藤碱含量测定方法的基础上对色谱条件进行了优 化。结果发现,青风藤碱和青藤碱对流动相的比例和 pH 值非常敏感,最终本研究将色谱条件确定为甲醇-2 mmol/L 磷酸氢二钠水溶液(含 0.016%三乙胺,pH 为 9.8)(45 ∶ 55,V/V)。在血浆样品处理方法的筛选过程中, 笔者分别尝试了蛋白直接沉淀法和液-液萃取法,先后 以甲醇、乙腈以及异丙醇、乙醚、氯仿、乙酸乙酯单独或不同比例混合作为沉淀或萃取试剂。经反复试验发 现,经乙酸乙酯萃取后,待测物的峰形较为理想且分离 度良好,回收率相对较高且稳定,故最终选择乙酸乙酯 作为萃取溶剂。方法学考察结果显示,本研究所建 HPLC法具有简便、专属性强和灵敏度高的优点,且提取 方法不影响待测物的定量分析,符合生物样品定量分析 的相关要求,可用于血浆样品中青风藤碱含量的测 定。此外,本研究所建标准曲线的线性范围虽然较窄 (0.1~5.0 mg/L),但由于后续药动学实验给药剂量单 一、家兔体内血药浓度变化亦不大,故实用性尚可。



 


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