HUVEC细胞血管形成的影响(其林贝尔VORTEX–6使用

伊曲康唑(图 1)，分子式为 C35H38Cl2N8O4，是临 床应用广泛的抗真菌药物，属于三唑类抗真菌药物家 族的关键成员．它存在于世界卫生组织的基本药物 清单上，是基本卫生系统中最重要的药物之一，其安 全性毋庸置疑．目前可用的口服抗真菌剂伊曲康唑 是一种有效的 Hedgehog 途径拮抗剂，通过抑制羊毛固醇 14α 去甲基化酶(麦角固醇合成的关键酶)破 坏真菌细胞膜结构完整性，从而使真菌生长受到有效抑制。

1 材料与方法

1.1 材料

人慢性髓原白血病细胞株 K562、人早幼粒白血 病细胞株 HL-60、人急性 T 淋巴细胞白血病细胞株 Jurkat、人结肠癌细胞株 HCT-116、人肝癌细胞株 HepG2、人脐静脉内皮细胞 HUVEC，以上细胞株均 由天津科技大学生物工程学院药物设计与合成研究 室保存．人乳腺癌细胞 MDA-MB-468，美国菌种保藏 中心(ATCC)． PRMI-1640 细胞培养基、DMEM/F12(1﹕1)培养 基、DMEM 低糖培养基、DMEM 高糖培养基、青霉 素–链霉素溶液、巴西胎牛血清、0.25% 胰蛋白酶(1×) 溶液，赛默飞世尔科技公司． 伊曲康唑，分析纯，萨恩化学技术(上海)有限公 司；喜树碱(CPT)，分析纯，北京偶合科技有限公司； MTT、RNase，北京索莱宝科技有限公司；浓盐酸、异 丙醇，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；二甲基 亚砜，分析纯，美国 Amresco 公司；Annexin V-FITC 凋亡试剂盒，天津三箭生物技术有限公司；无水乙 醇，分析纯，天津市盛迪达贸易有限公司；碘化丙啶 (PI)，西格玛奥德里奇中国有限公司；Triton X-100， 宝生物工程(大连)有限公司． 超净工作台，苏州净化设备厂；Model 3100 series 型 CO2 培养箱，赛默飞世尔科技公司；TX323L 型电 子分析天平，岛津国际贸易有限公司；Infinite F50 型 基础酶标仪，帝肯(上海)贸易有限公司；CKX41 型奥 林巴斯倒置显微镜，奥林巴斯(中国)有限公司；TISR 型尼康荧光倒置显微镜，尼康仪器(上海)有限公 司 ；循环水 式 真 空 泵 、LX–300 型 迷你离心机 、其林贝尔VORTEX–6 型漩涡混合器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；342976 型流式细胞仪，碧迪医疗器械 (上海)有限公司；YXQ–LS–50SI 型立式压力蒸汽灭 菌锅，上海博迅实业有限公司．

1.2 方法

1.2.1 细胞增殖实验

采用 MTT 法检测细胞存活率．将处于对数生长 期的 K562 细胞、HL-60 细胞、Jurkat 细胞、HCT-116 细胞、HepG2 细胞、MDA-MB-468 细胞以及 HUVEC 细胞，1×PBS 清洗后分别用 0.25% 胰蛋白酶消化(贴壁细胞)，接种于 96 孔培养板内，细胞密度为 5×104 mL-1 ，每孔接种体积为 100 µL．将孔板置于 37 ℃、 5% CO2 培养箱中孵育一定时间(悬浮细胞孵育 2 h， 贴壁细胞孵育 24 h)．每组设 3 个平行孔，每孔加入 化合物体积为 0.5 µL．伊曲康唑实验组和 CPT 阳性 对照组的加药终浓度为 0.01、0.1、1、10、100 µmol/L. 同时，设置等体积 DMSO 溶剂为对照组．将孔板置 于 37 ℃、5% CO2 培养箱孵育 48 h 后，每孔加入 5 mg/mL MTT 20 µL，继续孵育 4 h 后终止培养．贴壁 细胞吸去孔内培养基，每孔加入 100 µL DMSO；悬浮 细胞每孔直接加入 100 µL 盐酸–异丙醇溶液后吹打 混匀，置于 37 ℃培养箱中 10 min 使甲 结臜 晶充分溶 解后，使用酶标仪(贴壁细胞选择 490 nm、620 nm； 悬浮细胞选择 580 nm、620 nm)测定吸光度(A)．按 照式(1)计算细胞存活率，并计算半数有效抑制浓度 IC50值． = 100% 实验 空白 对照 空白 细胞存活率 − × − A A A A (1)

1.2.2 K562 细胞增殖曲线绘制

将处于对数生长期的 K562 细胞以细胞密度为 5×104 mL-1 接种于 24 孔板上，每孔 1 mL，同时设置 对照孔；37 ℃、5% CO2 培养箱中培养 2 h，分别加入 终浓度为 1、3、10、30 µmol/L 伊曲康唑，每孔 5 µL．对照孔为细胞悬液中仅加入含相同浓度 DMSO．再将孔板置于 37 ℃、5% CO2 恒温培养箱 中，孵育 0、24、48、72、96、120 h，对不同处理时间不 同加药浓度的细胞分别进行计数，每组细胞计数 3 次，计算平均值并使用 GraphPad Prism 5 进行数据 分析．

1.2.3 K562 细胞形态学观察

将处于对数生长期的 K562 细胞以 5×104 mL-1 细胞密度接种于 6 孔板，每孔 2 mL，同时设置对照 孔．孔板置于 37 ℃、5% CO2培养箱中培养 2 h，分别 加入伊曲康唑终浓度为 1、3、10、30 µmol/L，每孔 10 µL ．对 照 孔 细 胞 悬 液 中 仅加入相 同 体 积 DMSO．再将孔板置于 37 ℃、5% CO2 恒温培养箱中 分别孵育 24 h 和 48 h，在对应的时间点使用显微镜 观察 K562 细胞的形态变化，并进行图像采集．

1.2.4 Annexin V-FITC/PI 双染法检测伊曲康唑对 K562 细胞凋亡的影响

将处于对数生长期的 K562 细胞以 5×104 mL-1 细胞密度接种于 6 孔培养板，每孔 2 mL，置于 37 ℃1、3、10、30 µmol/L 的伊曲康唑；培养箱孵育 48 h 后，1 000 r/min 离心 5 min，弃上清液，用预冷的 1× PBS 吹悬细胞，2 500 r/min 离心 5 min，再次弃去上清 液，冰浴；加入 100 µL 1×Binding Buffer 重悬细胞， 转移至室温下进行染色．首先，加入 5 µL Annexin VFITC，轻轻振荡混匀，避光孵育 10 min；然后再加入 20 µg/mL PI 5 µL，轻轻吹打混匀，避光孵育 5 min；最 后补加 400 µL 1×Binding Buffer 并立即使用流式细 胞仪进行测试，实验需在 1 h 内完成，防止 FITC 及 PI 荧光淬灭影响实验结果的准确性．

2 结果与分析

通过 MTT 法对 6 株不同的肿瘤细胞进行了体外 抗肿瘤活性测试，发现伊曲康唑对白血病细胞，尤其 是 K562 细胞的抑制作用最为显著．伊曲康唑 抑制 K562、HL-60 细胞增殖的 IC50 值分别为(3.04± 2.30)、(6.62±1.74)µmol/L，而伊曲康唑抑制 Jurkat、 HCT-116、HepG2 及 MDA-MB-468 细胞增殖的 IC50 值均大于 100 µmol/L．本文选择 K562 细胞株展开伊 曲康唑抗肿瘤作用的后续研究．通过普通光学显微镜(放大 400 倍)观察发现：空白对照组的 K562 细胞生长状态较 旺盛，形态呈圆形，整体光亮；而伊曲康唑处理后 K562 细胞出现凋亡小体、细胞变长或细胞皱缩的现 象．细胞凋亡的早期主要表现为包浆形成空泡，空泡 与细胞分离后最终导致细胞破碎形成凋亡小体．细 胞形态呈长条状则提示伊曲康唑对 K562 细胞的细 胞周期可能存在阻滞的作用．于是，在接下来的实验 中进一步验证伊曲康唑对 K562 细胞凋亡和细胞周 期的影响．

3 讨 论

2017 年 6 月 30 日，中国侵袭性真菌感染工作组 报道了侵袭性真菌病(invasive fungal disease，IFD)是 血液系统恶性肿瘤患者重要的死亡原因之一，血液病 患者 IFD 的总体发病率不断呈现上升趋势，即使接 受造血干细胞移植后，IFD 病死率仍高达 50% ．值 得注意的是，IFD 的预防治疗与经验治疗策略中，伊 曲康唑都被作为推荐使用的抗真菌药物之一．



 

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