大鼠急性期脑炎症应的影响分析（QL-902使用）

脑出血（ICH）是较为严重的一种急性脑血管疾 病，约占全部脑卒中的10%~17%。本病发病死亡率高，在北美，ICH患者发病30 d内的死亡率约为44%， 仅有20%的患者预后良好。ICH患者的神经功能损 伤一般较为严重，急性期多伴有头痛、单侧虚弱、呕吐、 癫痫和意识障碍等症状，即便好转之后常会遗留肢体 不遂，语言、感觉障碍等严重问题。血液破入脑实质或脑室，不仅直接损伤神经系统，而且出血所触发的炎症 信号会引起促炎症细胞因子如细胞间黏附分子-1 （ICAM-1）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素1β（IL-1β）和白细胞介素-6（IL-6）的表达异常，从而 产生炎症级联反应，造成神经功能继发性损伤。本实 验采用自体血注射所制备的大鼠ICH模型，以针刺水 沟、内关为干预方法，观察不同针刺施术时长下ICH急 性期大鼠脑血肿周围区域ICAM-1、TNF-α、IL-1β、IL6、HSP70含量的变化规律，从炎症反应与脑组织保护 角度，探究不同针刺量学条件下的作用机制。现报告 如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选用健康的 SPF 级 8 周龄左右雄性 SD大鼠共40只，体质量（300±25）g。实验大鼠由北京 维通利华实验动物技术有限公司提供，实验动物生产 许可证号：SCXK（京）2016-0002。于中国医学科学院 放射医学研究所饲养，实验动物使用许可证：SYXK （津）2014-0002。环境温度20~25 ℃，昼夜规律饲养。

1.2 试药与仪器

小鼠单克隆抗体 ICAM-1（Abcam 公司，编号 171123）、小鼠单克隆抗体 TNF-α（Abcam 公司，编号 220210）、兔多克隆抗体 IL-1β（Abcam 公 司，编号9277）、小鼠单克隆抗体IL-6（Abcam公司，编 号9324）、小鼠单克隆抗体HSP-70（Abcam公司，编号 2787）；苏木素、DAB 显色试剂盒（北京中杉金桥生物 技术有限公司）；涡旋振荡仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公司，型号其林贝尔QL-902）；恒温水浴箱（江苏太仓医 用仪器厂，型号 DSHZ-300）；离心机（Eppendorf 公司， 型号5430）；石蜡切片机（莱卡公司，型号RM2015）；显 微镜（奥林巴斯公司，型号：BX51T-PHD-J11）；医用X 射线胶片（柯达公司）；多功能真彩色细胞图像分析管 理系统（Media Cybernetics公司，Image-Pro Plus）；针灸 针（华佗牌，规格0.25 mm×40 mm）。

1.3 分组与造模

采用 SPSS19.0 软件系统产生随机 数法将48只大鼠随机分为4组，假手术组、模型组、针 刺5 s组、针刺60 s组，每组10只。Sham组于术后次日 开始模拟针刺组的捉抓过程，每日1次；模型组于造模 成功后次日开始模拟针刺组的捉抓过程，每日1次；针 刺组于造模成功后次日开始针刺干预，每日1次。大 鼠在干预5 d后（假手术、造模后第6日）断头取脑，制 备石蜡切片和冻存样品。本次实验对实验动物的处理 符合国际兽医学编辑协会编纂的《关于动物伦理与福 利的作者指南共识》。采用尾状核自体血注入法制作 ICH 模型。大鼠经 10%水合氯醛水溶液腹腔注射麻 醉，剂量为300 mg/kg，麻醉后剃除头顶毛；断尾取血并 将血挤入抗凝管内，用微量注射器抽入微量注射器 （100 μL）中备用。俯卧位，固定其于大鼠脑立体定位仪，先固定耳间线，移头部至正中，固定门齿于齿沟上， 调整脑定位仪，使门齿沟平面略低于耳间线平面；碘伏 溶液皮肤消毒后沿正中皮肤、肌肉剪开约1.5 cm纵向 切口，血管钳分离，过氧化氢水溶液拭去颅骨骨膜，显 露颅骨，暴露颅骨上的前囟和冠状缝区域，此时大鼠尾 部正对实验者，以前囟为原点，在向前旁开2 mm，向右 旁开 3 mm 处，用直径 1 mm 骨钻钻孔，孔直径约为 1 mm，以不损伤脑组织，钻尖下落空感为度；将定位仪 上的微量注射器针尖移至要注射的部位，缓慢进针 5 mm，向尾状核内缓慢（7 mins）注入50 μL自体全血， 留针 10 mins 后将注射针缓慢退出，并用骨蜡封闭钻 孔，缝合皮肤、肌肉并用碘伏溶液消毒防止创口感染； 置于温度适宜处自然苏醒，此过程应保持大鼠自主呼 吸。麻醉苏醒后，大鼠出现或不立即出现神经功能缺 损症状，归笼饲养，次日出现明显神经功能缺损症状， 认为造模成功。Sham组模拟皮肤、颅骨创伤过程但不 刺入脑组织。

1.4 针刺方法

两针刺组均选取大鼠“水沟”穴、双侧 “内关”穴，大鼠腧穴定位根据中国针灸学会实验针灸 研究会编写的《动物针灸穴位图谱》中的“水沟”“内关” 穴位置；水沟穴采用“雀啄”法，内关穴采用捻转泻法； 针刺5 s组各穴施快频率（3次/s）手法5 s，针刺60 s组 各穴施快频率（3 次/s）手法 60 s，刺毕不留针，每日 1 次，共5次。

1.5 标本采集与检测

1）各组取5只大鼠麻醉，行4% 多聚甲醛内固定术，打开胸腔暴露心脏，在右心耳剪开 小口，经左心室插入导管至升主动脉，显露导管；注射 200 mL 0.9%氯化钠注射液冲洗血液至心耳处流出清 水，肝脏颜色变浅；再经150 mL 4%多聚甲醛灌注至肝 脏、四肢、尾部僵硬 。断头处死后，在冰板上迅速开颅 取脑，放置于4%多聚甲醛溶液中待测；每只取血肿区 及周围脑组织约100 mg，制备免疫组化切片；
2）另取5 只大鼠，断头取脑，分离血肿区及周围脑组织作蛋白质 印迹法（Western blotting）分析脑血肿区 HSP-70 蛋白 表达；免疫组化法检测脑血肿区ICAM-1、TNF-α、IL1β、IL-6含量。

1.6 统计学处理

应用 SPSS19.0 统计软件。计量资 料以（x±s）表示，样本定量分析应用单因素方差分析， 方差齐时用LSD检验，方差不齐时使用Dunnett′-T3 检 验。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

假手术组ICAM-1阳性细胞为生理性表 达；与假手术组比较，模型组、针刺5 s组、针刺60 s组 ICAM-1表达增强；与模型组比较，针刺5 s组ICAM-1 表达差异无统计学意义（P > 0.05）；针刺60 s组表达减少（P < 0.05）。假手术组IL-6阳性细胞为生理水平表达； 与假手术组相比，模型组、针刺5 s组、针刺60 s组IL-6 表达增强；与模型组比较，针刺5 s组、针刺60 s组IL-6 表达减少（P < 0.05），且针刺 60 s 组降低更明显（P < 0.05）。

3 讨 论

ICH在中医理论中可归于“中风”病范畴，中医经 典中也以“大厥”“薄厥”“仆击”“风痱”“偏枯”等名称记述，病势多较危急，本病病因正气亏虚，情志、饮食、劳 倦内伤，病机为气血逆乱，血溢脑脉之外，产生风、火、 痰、瘀等病理产物，以突然昏仆、口舌歪斜、半身不遂、 言语謇涩或失语等症状为主要临床表现，有中经络、中 脏腑之分。针刺是 ICH 急性期临床上广泛应用的疗 法，其中研究较多的具体方法主要有醒脑开窍针法与 头皮针透刺法，本实验以醒脑开窍法为基础，以醒脑开 窍主穴“水沟”“内关”穴为干预腧穴，探究在不同手法 作用时长下的大鼠脑组织炎症反应因子的含量变化。



 

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