土壤细菌群落多样性的影响（其林贝尔QL-901使用

0 引言

  香蕉作为热带和亚热带水果在人 们的日常生活中扮演着重要角色。近年来，随着香 蕉枯萎病的不断加剧和蔓延，已给我国乃至全球香 蕉产业带来了重创。香蕉 枯萎病是一种极具破坏性的土传病害，其发病过程 为尖孢镰刀菌侵染香蕉维管束，维管束腐烂坏死，香蕉枯萎死亡。香蕉枯萎病于1967 年首次出现在我国台湾省，随后从广东蔓延至福建， 并迅速扩展到海南、广西、云南等其他香蕉种植区 ，严重威胁我国香蕉 种植业的发展。目前应对香蕉枯萎病的主要措施有 化学防治、物理防治、培育抗病品种、生物防治及田 间综合管理等，其中，生物防治措施凭借其对环境污 染小、安全程度高、能提高香蕉产量和品质等优点而 越来越受到研究者们的重视。

1 材料与方法

1. 1 试验地概况

试验地位于广东省湛江市徐闻县迈陈镇那种 基地（东经110°10′ 17.90″，北纬20°19′ 39.90″），气候 类型为热带季风气候，年平均气温23.5 ℃，年平均降 水量1364 mm。试验区为连续8年种植韭菜的平整 地块，土壤类型为砖红壤，土壤理化性质为有机质 14.4 g/kg、碱解氮62.3 mg/kg、有效磷（P2O5）38.0 mg/ kg、速效钾（K2O）108.6 mg/kg、pH 5.6。

1. 2 试验材料

供试香蕉品种：巴西蕉（Cavendish，cv. Brazilium AAA，香蕉枯萎病感病品种）组培苗。供试病原菌： 带有标记绿色荧光蛋白的香蕉枯萎病菌4号生理小 种（简写GFP-FOC4），由广东省农业科学院果树研究 所李春雨博士馈赠，致病性与野生型菌株一致。供 试生防菌：解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）XP1，由广东省农业科学院农业资源与环境研 究所提供。XP1培养条件：利用PDA和LB混合培养 基在28 ℃的培养箱中连续培养5 d，抑菌圈直径为 62.5 mm（孙杰，2018）；PDA和LB混合培养基配方： 马铃薯200 g、葡萄糖（C6H12O6 ·H2O）20 g、胰蛋白胨 10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g、蒸馏水1000 mL。 主要试剂：MOBIO PowerSoil® DNA Isolation Kit试剂盒（货号12888-100）购自北京宝杰罗生物科 技有限公司（MOBIO）；Premix Taq（E×Taq Version 2.0 Plus）（货号RR902A）、DL15000 DNA Marker（货 号 3582A）、100 bp DNA Ladder（货 号 3422A）和 DL2000 DNA Marker（货号3247A）购自宝日医生物 技术（北京）有限公司（TaKaRa）；Primer（订购合成） 和 Quant-iTTM Broad-Range DNA Assay（ 货 号 Q32853）购自美国英杰生命技术有限公司（Invitrogen）；琼脂糖（货号111860）购自广州浩玛生物科技有 限公司。主要仪器：PCR扩增仪（型号 ABI9600，美 国）和Daek reader（型号DR-46B）购自Clare Chemical Research；QubitTM Fluorometer（型 号 Qubit® 2.0 Fluorometer）购自Invitrogen公司；微型离心机（型号 Baygene BG-Qspin#8482）购自Baygene；涡旋混合器 （型号其林贝尔QL-901）购自其林贝尔仪器制造有限公司；凝 胶成像仪（型号Tanon 4100）购自上海天能科技有限 公司。

1. 3 试验方法

1. 3. 1 试验设计

试验设3个处理，每处理3次重 复，随机区组排列，共9个小区，小区面积223 m2 。其 中，CK：健康蕉园+每株0.5 L灭菌PDA培养基灌根+ 每株0.5 L灭菌LB培养基灌根；DI：健康蕉园+香蕉枯 萎病菌（菌液浓度1×109 个/mL，接种量0.5 L/株）+每 株0.5 L灭菌LB培养基；TR：健康蕉园+香蕉枯萎病 菌（菌液浓度1×109 个/mL，接种量0.5 L/株）+生防菌 （菌液浓度1×109 个/mL，接种量0.5 L/株）。 香蕉枯萎病菌采用灌根法在香蕉7~8片叶、株 高40~50 cm时接种。TR处理生防菌剂是在香蕉枯 萎病菌接种后24 h灌根。香蕉种植密度为60株/223 m2 ，起垄种植，株行距1.5 m×2.5 m。

1. 3. 2 根际土壤采集方法

土壤样品于DI处理小 区95%香蕉植株出现发病症状时进行采集（约移栽后100 d）。参照Zhao等（2016）的根际土壤采集方 法，在每小区按发病重度、中度、轻度各采取4株完整 植株根际土壤。将采集的根际土壤混合均匀，分成 两份，一份约2000 g室温保存，用于土壤理化性质测 定；一份约500 g放入无菌密封袋装入冰盒，带回实 验室-80 ℃保存，用于细菌群落多样性分析。

1. 3. 3 理化性质测定方法

土壤pH采用pH计、全 磷采用钼锑抗比色法、全氮采用半微量凯氏定氮法、 碱解氮采用碱解扩散法进行测定（鲍士旦，1999）；土 壤速效磷和速效钾分别采用碳酸氢钠浸提钼锑抗比 色法和乙酸铵浸提火焰光度法进行测定（张甘霖和 龚子同，2012）；硝态氮和铵态氮采用流动注射分析 法进行测定。

2 结果与分析

2. 1 生防菌XP1对香蕉枯萎病的防治效果

由表1可知，CK处理香蕉植株无发病现象；DI处 理在接种香蕉枯萎病菌GFP-FOC4后蕉园的发病率 高达95.0%，病情指数为68.3；TR处理接种生防菌 XP1后蕉园的发病率为13.3%，与DI处理相比差异达极显著水平（P<0.01，下同），病情指数降低至10.8， 防治效果显著，达84.2%。TR处理香蕉枯萎病发病 率较DI处理降低81.7%（绝对值），说明生防菌对香蕉枯萎病菌具有较强的拮抗作用。

2. 2 Observed species指数分析结果

共测序获得886890个序列，在97%的相似水平 下聚类后获得61660个OTUs。测序结果显示，3个样品的所有优质序列经聚类注释后归属于40个菌门。 从图1可看出，当测序深度达80000个序列时，各处理 的Observed species指数曲线趋向平缓，上升速度减 缓，说明测序深度已基本覆盖样品中绝大部分物种； 在同等测序深度上，无发病现象的CK处理实际观测 到的物种数最多，当测序深度达70000个序列时，接 种致病菌的DI处理实际观察到的物种数低于CK处 理、高于TR处理，随测序深度的加大，接种生防菌的 TR处理其实际观测到的物种数略高于DI处理、低于 CK处理。

3 讨论

近年来，由于连作、施肥不当和线虫危害等导致的土传病害越来越普遍，给农业生产带来重大经 济损失。研究发现，土传病害的发生主要与土壤微 生物群落结构失衡、生态环境恶化等有关（van Bruggen and Semenov，2000）。生物防治是目前用于防 控香蕉枯萎病最受欢迎的一种绿色安全措施，其原 理是利用生防菌来抑制病原菌的繁殖和增长，从而 使土壤微生物生态系统维持均衡。

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