自然发酵过程中细菌群落结构分析（GL－88B使用）

刺梨( Ｒosa roxburghii Tratt) 又名茨梨，一种野生 小灌木，是西南地区常见的野生植被，成熟的刺梨果 实表面呈黄色且单宁酸含量高，含有大量的酚类化 合物，涩味重。刺梨树是贵州省种植面积最大的野 生果树资源，果实含有丰富的维生素 C、超氧化 物歧化酶( SOD) 、类黄酮、以及氨基酸等多种 有效物质，在营养、保健和医药方面具有极高的研究 利用价值。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

刺梨 采自贵州省龙里县刺梨种植基地; 红 糖 市购; DNA 抽提试剂盒( E.Z.N.ATM Mag － Bind Soil DNA Kit) 美国欧米茄公司; Qubit3.0 DNA 检测 试剂盒 美国生命技术公司; 2 × Taq Master Mix 南 京诺唯赞生物科技有限公司; MagicPure Size Selection DNA Beads 北京全式金生物科技有限公司; 细菌通 用引物( 341F，805Ｒ) 生工生物工程( 上海) 股份有 限公司。 Pico－ 21 台式离心机 赛默飞世尔科技公司; 其林贝尔GL-88B漩涡混合器 海门市其林贝尔仪器制造有限公司; TND03－H－H 混匀型干式恒温器 深圳拓能 达科技有限公司; DYY－6C 电泳仪电源、DYCZ－21 电 泳槽 北京市六一仪器厂; 凝胶成像系统 美国 UVP; T100TM Thermal Cyele PCＲ 仪 美国伯乐公 司; Q32866Qubit  3.0 荧光计 美国英杰生命技术 有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 刺梨发酵液制备

先将 10 L 的白色塑料桶用 75% 的酒精经表面杀菌后备用，将榨汁后( 刺梨果出 汁率约为 60% ) 的刺梨果粉碎，参照朱丽梅等方 法，将刺梨果渣、水、红糖按质量比 3∶ 10∶ 1装在塑料 桶中，摇匀，密封发酵，每隔 6 d 放一次气搅拌并取 样，连续发酵 60 d。

1.2.2 样品总 DNA 的提取

样品前处理: 取 2 mL 发 酵液样品，加入到已灭菌的离心管中，在 10000 r /min 离心 3 min，弃上层液，沉淀倒置吸水 纸 上 1 min， 滤干。 样品总 DNA 的提取: 具体提取步骤参照试剂盒 使用说明书操作，然后再利用 1% 琼脂糖凝胶检测 DNA 完整性，再进行下一步分析。

1.2.3 细菌

16S rDNA 基因 PCＲ 扩增 利用 DNA 检 测试剂盒对基因组 DNA 精确定量，以确定 PCＲ 反应 需要加入的 DNA 量。PCＲ 所用的引物已经融合了 Miseq 测 序 平 台 的 V3 － V4 通 用 引 物 ( 341F， 805Ｒ) 。 将配置好的 PCＲ 体系( 30 μL 体系) 按照下列条 件进行 PCＲ 扩增: 94 ℃预变性 3 min，94 ℃变性处理 30 s，45 ℃退火 20 s，65 ℃延伸 30 s，5 个循环; 94 ℃ 变性处理 20 s，55 ℃退火 20 s，72 ℃延伸 30 s，20 个 循环，72 ℃ 延伸 5 min。PCＲ 结束后进行第二轮扩 增，引入 Illumina 桥式 PCＲ 兼容引物，配置好的 PCＲ 体系( 30 μL 体系) 按照如下反应条件进行 PCＲ 扩 增: 95 ℃预变性 3 min，94 ℃ 变性处理 20 s，55 ℃ 退 火 20 s，72 ℃ 延伸 30 s，5 个循环; 72 ℃ 延伸 5 min， 降温到 10 ℃。扩增完成后，回收 PCＲ 产物并纯化。

1.2.4 Illumina MiSeq 高通量测序

将所得到的 PCＲ 产物送往生工生物工程( 上海) 股份有限公司进行高 通量建库和细菌多样性分析。测序完成后进行 DNA 序列拼接和质量控制，并以此为基础进行生物学信 息分析。

1.2.5 多样性分析

根据 OTU 聚类分析的结果，采 用 Mothur 在 OTU 相似水平在 97% 的条件下计算多 样性指数，包括 OTU 数量、香农指数、Chao1 指数、森 普森指数、Ace 指数和覆盖率指数。

1.2.6 群落组成分析

利用 blastn 将 OTU 序列与相 应数据库进行比对，观测样品在不同分类水平上的 群落结构，筛选出 OTU 序列的最适比对结果并在默 认满足相似度 ＞ 90% 的基础上，选取不同分类水平 上的细菌群落进行统计分析，根据分析结果，利用软 件绘制所有样本群落结构分布柱状图、物种可视化 圈图等进行群落组成分析。 1.3 数据处理 数据处理采用 Ｒ 语言和 mothur( https: / /mothur. org /wiki /Chao /Ace / Shannon / Simpson /Coverage ) 软 件 进 行 分 析，利 用 cutadapt ( https: / / pypi.org / project / cutadapt /1.2.1 /) 去 除 接 头，PEAＲ ( https: / /cme.h －its.org /exelixis /web / software / pear /) 进 行 序 列 对 拼， Prinseq ( http: / / prinseq.sourceforge.net /) 质 量 剪 切。 测序获得的基因序列与 Silva ( http: / /www.arb － silva.de /) 、NCBI 16S( http: / / ncbi.nlm.nih.gov /) 、ＲDP ( http: / / rdp.cme.msu.edu /misc / resources.jsp) 数 据 库 进行比对。

2 结果与分析

Alpha 多样性指数统计如表 2 所示，刺梨果渣在 分别发酵 6、12、18、24、30、36、42、48、54 和 60 d 时间 点上，10 个样品的 OTU 数量和 ACE 指数在发酵 6 和 12 d 总体变化不大; ACE 指数用来估计群落中 OTU 数目的指数，ACE 指数在 12 和 18 d 值较大，表明了 12～18 d 随着发酵的进行发酵刺梨果渣中细菌群落 丰度逐渐增大; 发酵 24 d 以后样本中的 OTU 数量和ACE 指数开始下降; 在发酵 54 d 时 ACE 指数最大， 达 1311.29，说明发酵到第 54 d 时已达到发酵的最高 时期，发酵最后 60 d 物种多样性开始下降。香农指 数用来反映微生物多样性，指数越大，群落多样性越 高，对 10 个样本中的香农指数随着发酵时间的变化 可知，在发酵 6 d 时香农指数较高，其次是 12 d，表明 刚开始发酵到 12 d 时，刺梨果渣中细菌群落多样性 逐渐增高，其余发酵时间香农指数相对较稳定。森 普森指数用于估算样品中微生物多样性指数之一，森普森指数值越大，说明群落多样性越低，由，发酵到 18 d 时样本多样性最低。发酵过程中 10 个样本的覆盖率均在 99% 以上，甚至在发酵 18、24、 和30 d 时覆盖率达100% ，表明了测序的数据能够覆 盖目前状态下样品中的细菌种类，测序量已经达到 最大值，能够真实映射样本中的细菌群落情况，可以 用于后续的分析。Chao1 指数在发酵前 6、12 和 18 d 时值最高，一般 Chao1 指数在生态学中常用来估计 物种总数，细菌群落物种总数最高，说明该阶段的细 菌群落最丰富; 后期 Chao1 指数趋于稳定，表明发酵 后期细菌群落物种趋于稳定。

3 结论

采用高通量测序技术对贵州省龙里县刺梨 种植基地的刺梨果渣在自然发酵过程中( 0～60 d) 的 细菌群落结构及多样性进行分析，分析共检测出 26 个门类、40 个纲类群、74 个目类群、162 个科类群、373 个属类群。在整个发酵过程中，主要以葡糖杆菌 属和醋酸杆菌属为主。虽然发酵后期葡糖杆菌属和 醋酸菌属大量生长繁殖，成为整个发酵过程中的优 势菌群，使其它细菌相对丰度降低，但这些菌群在发 酵过程中一直存在，所以总体上细菌的多样性变化 趋势并不大，这很大程度上有可能是因为发酵过程 一直处于密封环境中，容器中的微量氧气慢慢被消 耗，发酵后期逐渐形成厌氧环境，微好氧菌快速繁 殖，抑制其它菌群生长，使菌群中比例占优势的好氧 菌大量减少而造成的。



 

免责声明：文章仅供学习和交流，如涉及作品版权问题需要我方删除，请联系我们，我们会在第一时间进行处理。