帕金森病模型大鼠脑黑质影响分析（SHZ-88使用）

帕金森病( Parkinson’s disease，PD) 是一种常见于中老 年人的神经系统变性疾病，其主要有两大病理特征，其一是 以黑质多巴胺能神经元及其他含色素的神经元大量变性丢 失，尤其是黑质致密区多巴胺能神经元丢失最严重; 其二是 在残存的神经元胞质内出现嗜酸性包涵体，即路易小体 ( Lewy body) 。目前 PD 的确切病因和发病机制仍未完全明 了，认为是多因素交叉作用下发病，遗传易感性增加患病几 率，在环境因素、神经系统老化等因素共同作用下，通过氧 化应激、线粒体功能紊乱、蛋白酶体功能障碍、炎症和( 或) 免疫反应、钙稳态失衡、兴奋性毒性、细胞凋亡等机制导致 黑质多巴胺能神经元大量变性、丢失，才会发病。近年 来发现内质网应激( EＲS) 介导的凋亡在 PD 的发病机制中 有重大作用。

1 材料与方法

1． 1 实验材料

1． 1． 1 实验动物

实验动物为 SPF 级雄性 SD 大鼠，体质 量 200 ～ 250 g 之间，由辽宁长生生物技术有限公司提供， 实验动物许可证编号: SCXX( 辽) 2015 － 0001。大鼠饲养于 辽宁中医药大学实验动物中心，使用许可证号: SYXK( 辽) 2013 － 0009。饲养温度 18 ～ 22 ℃，相对湿度: 40% ～ 70% 。

1． 1． 2 实验药品

独活饮片、独活颗粒剂、独活复方颗粒 剂、塞来昔布胶囊、美多芭片购自辽宁中医药大学附属医院 药局，独活香豆素由沈阳药科大学提取，独活复方源自唐代 孙思邈《备急千金药方·风懿》独活汤。

1． 1． 3 实验试剂

Lactacystin、阿扑吗啡，购自美国 Sigma 公司; TriZol( 批号 14105) ，购自 Invirogen 公司; 逆转录试剂 盒( 批号 0051509) ，购自 New England Biolabs; 扩增试剂盒 ( 批号 0006231745) ，购自 Agilent; 蛋白质裂解液、一抗稀释 液、ECL 化学发光试剂，购自碧云天生物技术研究所; 蛋白 测定试剂盒，购自鼎国生物技术有限公司; 兔抗人 β － Actin 多克隆抗体，购自 Santa Cruz; 羊抗兔 HＲP － IgG，购自 Santa Cruz; anti － CHOP、anti － Caspase12，购自 cell signal 公司。

1． 1． 4 仪器设备

全自动脑立体定位仪，德国 Neurostar stereodrive 生产; 多功能酶标仪( TriStar2 LB 942 型) ，德国 伯托生产; 水浴恒温振荡器( 其林贝尔SHZ-88 型) ，其林贝尔公司 生产; 台式多功能冷冻高速离心机，德国赛默飞生产; 垂直 板电泳装置( Mini － Protean tetra 型) ，美国 Bio － Ｒad 公司 生产; 半干转转膜仪( Trans － Blot SD 型) ，美国 Bio － Ｒad 公 司生产; 全自动荧光与可见光凝胶成像分析系统( F3 型) ， 英国 Syngene 公司生产。

1． 2 方法

1． 2． 1 模型制备及分组

采用脑黑质致密部注射 Lactacystin 的方法复制 PD 大鼠模型。根据《大鼠 脑立体定位图谱》，结合预实验结果，模型复制大鼠定位 注射 10 μg Lactacystin( 2 μL) ，另设假手术组和正常对照 组，假手术组定位注射等体积生理盐水，具体方法请参考。模型复制后观察大鼠一般行为学改变，并于造模后 的第 7、14、21、28 天，进行阿扑吗啡( APO) 检测，观察并记 录大鼠旋转方向及旋转圈数。于最后一次 APO 检测后，根 据大鼠行为学异常程度，应用分层随机法，将模型复制大鼠 分为 7 组: 模型对照组、吐温 80 组、独活香豆素组、独活颗 粒剂组、独活复方颗粒剂组、塞来昔布组、美多芭组。

1． 2． 2 药物干预

各组大鼠给药剂量按照人与大鼠剂量 换算公式进行计算，独活香豆素、独活颗粒剂及独活复方颗 粒剂均以含生药剂量为准，独活香豆素、独活颗粒剂依据前 期研究予常规剂量的 3 倍量。即独活香豆素组: 3 g· kg － 1 ·d － 1 ; 独活颗粒剂组: 3 g·kg － 1 ·d － 1 ; 独活复方颗粒 剂组: 6． 3 g·kg － 1 ·d － 1 ; 塞莱昔布组: 20 mg·kg － 1 ·d － 1 ; 美多芭组: 25 mg·kg － 1 ·d － 1 ; 吐温 80 组: 0． 08% 吐温 801 mL·100 g － 1 ·d － 1 ; 正常对照组、模型对照组、假手术组: 等 体积生理盐水。除独活香豆素用 0． 08% 吐温 80 助溶外， 其余药物均用生理盐水配制，体积相同。给药时间上午 8 ∶ 00 － 10 ∶ 00，日 1 次灌胃。每周称体质量 1 次，根据大鼠体 质量每周调整药物剂量( 体积) ，连续给药 10 周。

1． 2． 3 行为学检测

给药后观察各组大鼠是否出现一般 行为学异常; 并于给药后的第 14、28、42、56、70 天，进行 APO 检测，观察大鼠旋转行为、旋转方向及旋转圈数并记 录。

1． 2． 4 指标检测

大鼠于最后一次 APO 检测后的次日， 每组随机选取 6 只大鼠，过度麻醉处死，断头，取左侧脑黑 质，分别采用 ＲT － PCＲ( 每组 3 例) 、Western － blot 法( 每组 3 例) ，对大鼠脑黑质 CHOP、Caspase12 mＲNA 和蛋白表达 水平进行检测。 ( 1) ＲT － PCＲ 检测: 采用实时荧光定量 PCＲ 法，对各 组大鼠脑黑质中 CHOP、Caspase12 mＲNA 的表达水平进行 检测。取新鲜的脑黑质组织 100 mg，按照 TriZol 说明书提 取总 ＲNA。取 1μg 的总 ＲNA，用 ProtoScript II First Strand cDNA Synthesis Kit 试剂盒反转录合成 cDNA。cDNA 稀释 4 倍后，用于实时荧光定量 PCＲ 检测。荧光定量 PCＲ 使用 Brilliant II SYBＲ Green QPCＲ Master Mix 试剂盒。PCＲ 反 应条件: 94 ℃，5 min; 40 × ( 94 ℃，20 s; 59 ℃，20 s; 72 ℃，30 s) 。引物序列见表 1，GAPDH 作为内参对照，基因的相对 表达量用 2 － △△Ct 法计算。

( 2) Western － blot 检测: 采用 western － blot 法检测各组 大鼠脑黑质组织中 CHOP、Caspase12 的表达水平。采用细 胞裂解液裂解法提取黑质组织中总蛋白，并测定蛋白浓度， 加入上样缓冲液煮沸变性后，以 50 μg /孔的总蛋白量进行 垂直电泳，湿转法将蛋白转印至 PVDF 膜，封闭液封闭 1 h， 一抗( 1 ∶ 500) 4 ℃孵育过夜，洗膜后，二抗( 1 ∶ 1500) 室温孵 育 2 h，洗膜后，将 PVDF 膜置于凝胶成像分析系统中，滴加 ECL 工作液，采集图像，并测定目的蛋白及内参蛋白条带灰 度值，并以目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值的比值作为该 样本中目的蛋白的相对表达水平，进行统计分析。

1． 2． 5 统计学方法

应用 SPSS 19． 0 统计分析软件进行 数据分析处理。所有实验数据均采用 x 珋± s 表示，组间比较 采用单因素方差分析，以P ＜ 0. 05 为有统计学意义。

2 结果

模型复制后，大鼠逐渐出现 食欲下降，自主活动减少，随着时间推移，多数大鼠相继出 现运动迟缓、震颤、对外界刺激反应下降、不自主竖毛、尾僵 等行为学改变。给予干预因素后，独活香豆素组、独活颗粒 剂组、独活复方颗粒剂组、塞来昔布组和美多芭组大鼠上述 症状均明显改善; 模型对照组和吐温 80 组大鼠症状无明显 改善; 假手术组和正常对照组在干预前后如常，未发现其行为学异常。模型复制大鼠腹腔 注射 APO 后，多数大鼠出现不同程度的旋转行为，表现为 身体弯曲，甚则首尾相接旋转。分组予以药物干预后，独活 香豆素组、独活颗粒剂组、独活复方颗粒剂组、塞来昔布组、 美多芭组大鼠旋转行为均较模型对照组和吐温 80 组有明 显改善，但以独活香豆素组改善最明显。

3 讨论

独活始载于《神农本草经》被列为上品，并有“久服轻身耐老”的记载。如今的《中药学》教材将独活列为祛风 寒湿药之首，辛、苦，微温，归肾、膀胱经，具有祛风湿，止痛， 解表的功效。综观中医历代文献记载，我们发现，独活还具 有调补五脏，尤善补肾，祛瘀化痰，宣通脑络之功，是一味入 阴而升阳，通补并用的良药。现代药理研究发现，独活 中含有 29 种香豆素，具有抗炎、调节免疫、钙拮抗、调控凋 亡、抗自由基、抗心律失常、扩冠、降压、抗血小板聚集和血 栓形成、镇痛、镇静、催眠、抗肿瘤、保肝、解痉、抗胃溃疡等 作用。我们曾经对独活、独活醇提物及独活香豆素延缓模 型鼠脑老化、痴呆、阿尔茨海默病( AD) 的研究，发现独活参 与了多种抗衰老机制的调节。近年来我们研究发现， 独活香豆素能够改善 PD 模型大鼠行为学异常，抗氧化应 激、增强抗氧化能力、减少兴奋性氨基酸 Glu 的异常增多、 降低血清炎症因子的含量，对抗 PD 损伤。目前的一 些研究显示，独活及其有效成分的作用已从传统的对风寒 湿痹传统疾病的治疗，拓展到抗肿瘤、保肝、对抗心血管系 统、生殖系统、骨性相关疾病及多发性硬化等疾病的治疗。 然而关于独活及其有效成分对 PD 的神经保护作用与内质 网应激( EＲS) 的关系研究尚未见到报道。



 

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