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察哈尔羊肌肉品质的重要分子研究(QL-901涡旋仪

返回列表 来源:未知 发布日期:2019-12-25 09:25【

察哈尔羊生长于内蒙古锡林郭勒盟正镶白旗、镶黄 旗和镶蓝旗地区,其母本为内蒙古地区的细毛羊,父本 为德国进口的美利奴羊,是我国自上世纪90年代开始培 育的肉毛兼用绵羊新品种。察哈尔羊4~6 月龄生长较 快,6~18 月龄日增体质量开始降低,其日增体质量最 高可达166.17 g,产肉性能较高。察哈尔羊羊肉肉嫩多 汁,脂肪含量适中,必需脂肪酸亚油酸含量较高,具有 较高的营养价值和保健作用。蛋白质是肌肉的重要组成 部分,其发生改变会引发肌肉质量的转变。不同部位 肌肉的理化特性及蛋白质组成不同。肉色、系水力、 肌内脂肪含量、pH值及嫩度等肉质评估标准会受到肌纤 维含型及比例的影响。


1 材料与方法 


1.1 材料与试剂 


实验样本由同一放牧条件下生长状况良好的3 只6 月 龄察哈尔公羊作为生物重复,分别采集3 只羊的背最长肌 和臀肌。 蛋白裂解液、尿素、胰蛋白酶、碘乙酰胺、二硫苏 糖醇、碳酸氢铵 美国赛默飞世尔公司;BCA蛋白浓度 测定试剂盒 北京碧云天生物科技有限公司。 


1.2 仪器与设备


-80 ℃冰箱 海尔集团公司;98-111N超声粉 碎仪 宁波新芝生物科技股份有限公司;Z323K低温离 心机 德国Hermle公司;QT-901涡旋仪 海门市其林贝尔仪器制造有限公司;Eksigent nanol 400液相色谱仪、 TOF-5600质谱仪 美国AB Sciex公司。 


1.3 方法 


1.3.1 总蛋白提取 


将肌肉样本于液氮中研磨成粉末后,取0.8 g于离心 管中,加入1 g/100 mL十二烷基硫酸钠裂解液,每隔1 min 在涡旋仪上涡旋30 s,20 min后结束;将样品用超声仪破 碎2 min后,4 ℃、12 000 r/min离心30 min,取上清;使用 BCA蛋白浓度测定试剂盒进行总蛋白浓度测定。 


1.3.2 总蛋白酶解 


取蛋白含量100 µg的样品,加入200 µL 8 mol/L 尿素、10 mmol/L二硫苏糖醇的混合溶液,37 ℃变性 1 h,12 000 r/min离心40 min,加入200 µL尿素,振荡、 12 000 r/min离心30 min,重复2 次;加入200 µL 50 mmol/L 碘乙酰胺避光反应30 min,12 000 r/min离心30 min; 加入100 µL 100 mmol/L碳酸氢铵,12 000 r/min离心 20 min,重复3 次;加入适量胰酶37 ℃孵育过夜,12 000 r/min离心30 min;加入50 µL 100 mmol/L碳酸氢 铵,12 000 r/min离心30 min,重复2 次;收集滤液,冻 干,备用。 


1.3.3 总蛋白鉴定 


用50 µL体积分数2%乙腈水溶液复溶酶解后的冻干 粉,利用数据信息依赖性获取(information dependent acquisition,IDA)与SWATH方法上机鉴定总蛋白与差异 蛋白。离子源:IDA扫描正离子模式,喷雾电压2.3 kV, 离子源温度150 ℃。蛋白鉴定方式:一级扫描方式: 全扫描;一级扫描范围:m/z 150~1 200;质谱分辨率设 为30 000;窗口0.4 Da;碎裂方式:诱导碰撞解离;碎 裂能量:动态碎裂;二级扫描范围:m/z 100~1 500;循 环方式:动态排除扫描;动态排除时间18 s;SWATH定 量方式:一级扫描方式:全扫描;一级扫描范围:m/z 150~1 200;质谱分辨率设为30 000;间隔窗口25 u(如 m/z 400~425、424~449、448~473,…,1 175~1 200); 碎裂方式:诱导碰撞解离;碎裂能量:动态碎裂;二级 扫描范围:m/z 100~1 500;循环方式:依次均匀扫描。 


1.4 数据处理及分析 


1.4.1 蛋白质鉴定 


利用Protein Pilot 4.5软件(AB Sciex公司)对采 集的背最长肌和臀肌IDA数据进行搜库,蛋白数据 库来源于Uniprot/Swiss-Prot(https://www.uniprot.org/ uniprot/?query=reviewed:yes)。 保留时间校准:利用PeakView 4.5软件(AB Sciex公 司)对背最长肌和臀肌的SWATH数据与IDA数据进行比 对,进行保留时间校准,做定量分析。 


1.4.2 差异蛋白的筛选 


通过LOG2(Fold Change)与-LOG10(P Value) 值绘制火山图,且应用Marker View软件(AB Sciex公 司),以P Value<0.05、Fold Change>2或<0.5作为阈 值筛选背最长肌和臀肌的差异蛋白。 


1.4.3 GO(gene ontology)富集分析 


使用DAVID Bioinformatics Resources 6.8(https:// david.ncifcrf.gov/)功能注释一栏对总蛋白和差异蛋白 分别在细胞学组分、分子功能及生物学过程方面进行分 类,使用默认设置进行注释。 


1.4.4 差异蛋白互作网络构建


使用在线生物信息网站String(https://string-db.org/) 进行蛋白质相互作用分析,String网站包含蛋白质网络相 互作用的丰富信息。首先将蛋白质全称上传到String 10.5 以获取蛋白质互作信息,所需的最低互动分数设置为中 等置信度(0.7),最后导入到Cytoscape 3.4.0软件中制作 视觉蛋白质互作网络图。


2 结果与分析


以UniProt/Swiss-Prot蛋白数据库为背景,对总蛋白 进行鉴定,初步建立察哈尔羊蛋白质表达谱。由图1可 知,1%假阳性条件下,背最长肌和臀肌中共检测到蛋白 质1 073 个,其中背最长肌中共检测到877 个,臀肌中共 检测到897 个,2 个部位的总蛋白数量相近。对察哈尔羊肌肉总蛋白进行GO组分富集分析,由 图2可知:在细胞组分中,富集于细胞外外泌体中的蛋白 质数量最多,其次富集于细胞质内的蛋白质数量较多; 在分子功能中,蛋白质主要参与聚RNA结合、ATP结合 和钙离子结合等功能;在生物学过程中,蛋白质主要参 与三羧酸循环、蛋白质结合和细胞氧化还原稳态等生物 学过程。


3 讨 论 


蛋白质是动物生理功能的体现者,可以从蛋白质组 学的角度分析与肉质相关的问题,并期望有效控制肌肉 质量。根据Doherty等的研究,蛋白质成分的变化可 能引起肌肉嫩度的变化。如今,蛋白质组学常用于多组 样品之间的蛋白质鉴定,筛选与肌肉品质相关的差异蛋白。本研究利用IDA和SWATH技术,对察哈尔羊背 最长肌和臀肌蛋白质组进行定性及相对定量分析,挑选 背最长肌中的枢纽差异蛋白,并对其进行功能分析。



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