察哈尔羊肌肉品质的重要分子研究（QL-901涡旋仪

察哈尔羊生长于内蒙古锡林郭勒盟正镶白旗、镶黄 旗和镶蓝旗地区，其母本为内蒙古地区的细毛羊，父本 为德国进口的美利奴羊，是我国自上世纪90年代开始培 育的肉毛兼用绵羊新品种。察哈尔羊4～6 月龄生长较 快，6～18 月龄日增体质量开始降低，其日增体质量最 高可达166.17 g，产肉性能较高。察哈尔羊羊肉肉嫩多 汁，脂肪含量适中，必需脂肪酸亚油酸含量较高，具有 较高的营养价值和保健作用。蛋白质是肌肉的重要组成 部分，其发生改变会引发肌肉质量的转变。不同部位 肌肉的理化特性及蛋白质组成不同。肉色、系水力、 肌内脂肪含量、pH值及嫩度等肉质评估标准会受到肌纤 维含型及比例的影响。

1 材料与方法 

1.1 材料与试剂 

实验样本由同一放牧条件下生长状况良好的3 只6 月 龄察哈尔公羊作为生物重复，分别采集3 只羊的背最长肌 和臀肌。 蛋白裂解液、尿素、胰蛋白酶、碘乙酰胺、二硫苏 糖醇、碳酸氢铵 美国赛默飞世尔公司；BCA蛋白浓度 测定试剂盒 北京碧云天生物科技有限公司。 

1.2 仪器与设备

－80 ℃冰箱 海尔集团公司；98-111N超声粉 碎仪 宁波新芝生物科技股份有限公司；Z323K低温离 心机 德国Hermle公司；QT-901涡旋仪 海门市其林贝尔仪器制造有限公司；Eksigent nanol 400液相色谱仪、 TOF-5600质谱仪 美国AB Sciex公司。 

1.3 方法 

1.3.1 总蛋白提取 

将肌肉样本于液氮中研磨成粉末后，取0.8 g于离心 管中，加入1 g/100 mL十二烷基硫酸钠裂解液，每隔1 min 在涡旋仪上涡旋30 s，20 min后结束；将样品用超声仪破 碎2 min后，4 ℃、12 000 r/min离心30 min，取上清；使用 BCA蛋白浓度测定试剂盒进行总蛋白浓度测定。 

1.3.2 总蛋白酶解 

取蛋白含量100 µg的样品，加入200 µL 8 mol/L 尿素、10 mmol/L二硫苏糖醇的混合溶液，37 ℃变性 1 h，12 000 r/min离心40 min，加入200 µL尿素，振荡、 12 000 r/min离心30 min，重复2 次；加入200 µL 50 mmol/L 碘乙酰胺避光反应30 min，12 000 r/min离心30 min； 加入100 µL 100 mmol/L碳酸氢铵，12 000 r/min离心 20 min，重复3 次；加入适量胰酶37 ℃孵育过夜，12 000 r/min离心30 min；加入50 µL 100 mmol/L碳酸氢 铵，12 000 r/min离心30 min，重复2 次；收集滤液，冻 干，备用。 

1.3.3 总蛋白鉴定 

用50 µL体积分数2%乙腈水溶液复溶酶解后的冻干 粉，利用数据信息依赖性获取（information dependent acquisition，IDA）与SWATH方法上机鉴定总蛋白与差异 蛋白。离子源：IDA扫描正离子模式，喷雾电压2.3 kV， 离子源温度150 ℃。蛋白鉴定方式：一级扫描方式： 全扫描；一级扫描范围：m/z 150～1 200；质谱分辨率设 为30 000；窗口0.4 Da；碎裂方式：诱导碰撞解离；碎 裂能量：动态碎裂；二级扫描范围：m/z 100～1 500；循 环方式：动态排除扫描；动态排除时间18 s；SWATH定 量方式：一级扫描方式：全扫描；一级扫描范围：m/z 150～1 200；质谱分辨率设为30 000；间隔窗口25 u（如 m/z 400～425、424～449、448～473,…,1 175～1 200）； 碎裂方式：诱导碰撞解离；碎裂能量：动态碎裂；二级 扫描范围：m/z 100～1 500；循环方式：依次均匀扫描。 

1.4 数据处理及分析 

1.4.1 蛋白质鉴定 

利用Protein Pilot 4.5软件（AB Sciex公司）对采 集的背最长肌和臀肌IDA数据进行搜库，蛋白数据 库来源于Uniprot/Swiss-Prot（https://www.uniprot.org/ uniprot/?query=reviewed:yes）。 保留时间校准：利用PeakView 4.5软件（AB Sciex公 司）对背最长肌和臀肌的SWATH数据与IDA数据进行比 对，进行保留时间校准，做定量分析。 

1.4.2 差异蛋白的筛选 

通过LOG2（Fold Change）与－LOG10（P Value） 值绘制火山图，且应用Marker View软件（AB Sciex公 司），以P Value＜0.05、Fold Change＞2或＜0.5作为阈 值筛选背最长肌和臀肌的差异蛋白。 

1.4.3 GO（gene ontology）富集分析 

使用DAVID Bioinformatics Resources 6.8（https:// david.ncifcrf.gov/）功能注释一栏对总蛋白和差异蛋白 分别在细胞学组分、分子功能及生物学过程方面进行分 类，使用默认设置进行注释。 

1.4.4 差异蛋白互作网络构建

使用在线生物信息网站String（https://string-db.org/） 进行蛋白质相互作用分析，String网站包含蛋白质网络相 互作用的丰富信息。首先将蛋白质全称上传到String 10.5 以获取蛋白质互作信息，所需的最低互动分数设置为中 等置信度（0.7），最后导入到Cytoscape 3.4.0软件中制作 视觉蛋白质互作网络图。

2 结果与分析

以UniProt/Swiss-Prot蛋白数据库为背景，对总蛋白 进行鉴定，初步建立察哈尔羊蛋白质表达谱。由图1可 知，1%假阳性条件下，背最长肌和臀肌中共检测到蛋白 质1 073 个，其中背最长肌中共检测到877 个，臀肌中共 检测到897 个，2 个部位的总蛋白数量相近。对察哈尔羊肌肉总蛋白进行GO组分富集分析，由 图2可知：在细胞组分中，富集于细胞外外泌体中的蛋白 质数量最多，其次富集于细胞质内的蛋白质数量较多； 在分子功能中，蛋白质主要参与聚RNA结合、ATP结合 和钙离子结合等功能；在生物学过程中，蛋白质主要参 与三羧酸循环、蛋白质结合和细胞氧化还原稳态等生物 学过程。

3 讨 论 

蛋白质是动物生理功能的体现者，可以从蛋白质组 学的角度分析与肉质相关的问题，并期望有效控制肌肉 质量。根据Doherty等的研究，蛋白质成分的变化可 能引起肌肉嫩度的变化。如今，蛋白质组学常用于多组 样品之间的蛋白质鉴定，筛选与肌肉品质相关的差异蛋白。本研究利用IDA和SWATH技术，对察哈尔羊背 最长肌和臀肌蛋白质组进行定性及相对定量分析，挑选 背最长肌中的枢纽差异蛋白，并对其进行功能分析。

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