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测定油菜薹中反式维生素-其林贝尔摇床使用

返回列表 来源:未知 发布日期:2019-12-27 10:01【

1 材料与方法 


1. 1 材料与试剂

 20份油菜薹(甘蓝型油菜,Brassica napus L.)样 品采摘自中国农业科学院油料作物研究所试验基 地,其它蔬菜小白菜(上海青,B. rapa spp. chinen⁃ sis)、西兰花(B. oleracea var. Italic Planch)和结球甘 蓝(B. oleracea var. capitata)购买自实验室周边5个 超市和蔬菜市场。顺式维生素K1、反式维生素K1和 维生素 K1-D7 标准品购自加拿大 Toronto Research Chemicals公司;甲醇(色谱纯):赛默飞世尔科技(中 国)有限公司;正己烷(色谱纯):国药集团化学试剂 有限公司;乙酸乙酯(色谱级):上海阿拉丁生化科技股份有限公司;异丙醇:德国默克股份两合公司; 甲酸:上海阿拉丁生化科技股份有限公司;甲酸铵: 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;Mega Bond Elut AL-N:美国Agilent公司;Mega BE-SI:美国Agi⁃ lent 公司;Hicapt Benzo:维泰克科技(武汉)有限公 司 ;DIKMA ProElut C18:迪马科技 ;Simon Aldrich PCX:德国 Simon Aldrich 公司 ;Sep-Pak Vac Silica Cartridges:美国 Waters 公司;DIKMA ProElut SI:迪 马科技;Waters WCX:美国Waters 公司。

1. 2 仪器与设备

Waters YMC C30液相色谱柱(150 mm×4. 6 mm× 3 μm):日本YMC株式会社;液相色谱三重四级杆串 联质谱仪:美国赛默飞世尔科技有限公司;3205 食品加工机:德国 Braun 公司(产地:匈牙利);AUW220D 电子分析天平:日本岛津公司;移液枪(100 μL、200 μL、1 mL、5 mL):德国 Eppendorf 公司;XHC旋涡混匀器:常州未来仪器制造有限公司;HITA⁃ CHI CT6E 离心机:日本日立有限公司;DTC-27J 超 声波水浴锅:中国湖北鼎泰生化技术设备制造有限 公司;BCD-260WDBD型冰箱:青岛海尔股份有限公 司;Test Tube Shaker KB-5010 摇床:海门市其林贝尔仪器制造有限公司;BF-2000型氮气吹干仪:北京 八方世纪科技有限公司;50 mL具塞离心管:美国康 宁公司;10 mL 具塞离心管:中国上海贸易公司;一 次性无菌注射器:武汉市王冠医疗器械有限责任公 司;0. 22 μm 有机系滤膜:美国 Millipore 公司;250 μL玻璃内衬管:安捷伦科技有限公司;1. 5 mL进样 小瓶:美国Agilent公司。

1. 3 方法

1. 3. 1 标准溶液的配制

准确称取标准品顺式维 生素K1、反式维生素K1各50 mg于深棕色玻璃瓶中, 分别用色谱级甲醇溶解,定容至10 mL,混合均匀配 制成5 mg/mL的单一标准储备液。 准确称取1 mg维生素K1-D7同位素标准品于深 棕色玻璃瓶中,加入甲醇定容至10 mL,混合均匀配 制成 100 μg/mL 的维生素 K1-D7 同位素内标储备 溶液。 使用移液枪准确移取母液于棕色瓶中,加入纯 甲醇进行逐级稀释,配制成所需不同浓度的单一标 准品溶液以及混合标准品溶液(不同浓度的混合标 准 品 溶 液 均 含 有 50 ng/mL 维 生 素 K1-D7 ),储 存 于-20℃冰箱中,备用。

1. 3. 2 样品制备、提取及测定

样品应新鲜,洗净 后,擦去表面水分,用食品加工机制成匀浆保存于 冰箱待用,用时置于室温下解冻。 准确称取 0. 5 g 蔬菜匀浆样品于 50 mL 具塞离 心管中,加入 250 ng的同位素内标维生素 K1-D7,加 入5 mL异丙醇,涡旋混匀后超声5 min。加入10 mL 正己烷,涡旋振荡 10 min,然后以 4500 r/min 转速离 心6 min,将上清液转移至50 mL具塞离心管中。再 向下层溶液加入 10 mL 正己烷重复提取一次,在涡 旋混匀器上将沉淀旋开,振摇 10 min 后,以 4500 r/ min转速离心6 min。合并上清液,正己烷定容至25 mL。然后用移液枪移取 5 mL 上清液于 10 mL 试管 中,氮气吹干后加入1 mL正己烷溶解,待净化。 中性氧化铝柱用5 mL正己烷活化后,将上述正己烷复溶的1 mL提取液以1. 0 mL/min流速过柱,用 5 mL 正己烷以 1. 0 mL/min 流速淋洗小柱,最后用 8 mL正己烷:乙酸乙酯(80:20,V:V)溶液洗脱至10 mL 试管中,氮气吹干后加入 1 mL 甲醇复溶,经 0. 22 μm 有机滤膜过滤至 1. 5 mL 进样小瓶中,待 HPLCMS/MS分析。


2 结果与分析


油菜薹等蔬菜属于低脂性样品,但样品中叶绿 素、类胡萝卜等干扰物质含量较高,因此,检测前需 选取合适的固相萃取柱对提取液进行净化。本文 考察了 DIKMA ProElut C18,Waters WCX,Simon Al⁃ drich PCX,Hicapt Benzo,DIKMA ProElut SI,Mega BE-SI,Sep-Pak Vac Silica Cartridges,Mega Bond Elut AL-N 8种常用的固相萃取柱。考察8种SPE柱 对正己烷提取液的净化效果。图 1 结果表明,中性 氧化铝柱(图 1中第 5个柱)对蔬菜基质的净化效果 明显优于其它7种固相萃取柱。中性氧化铝柱洗脱 液颜色较浅,进一步说明其吸附叶绿素等干扰物质 能力强,净化效果好。中性氧化铝柱用于保留或去 除极性化合物,适用于醛、酮、醌和硝基化合物以及 在碱性介质中不稳定的物质的分离,因此,选择中 性氧化铝柱用于维生素K1的净化分析。


3 讨论

建立了油菜薹中维生素 K1顺反异构体的分析 检测方法。采用异丙醇和正己烷对油菜薹样品进 行提取后,再用氧化铝固相萃取柱净化,能有效分 离维生素 K1,净化除去叶绿素、类胡萝卜素等干扰 物。选用维生素 K1-D7同位素作为内标进行定量, 可有效消除基质效应,提高回收率和检测灵敏度。 通过 HPLC-MS/MS 选择反应监测模式(SRM),可以 降低噪音和基质背景,提高检测的灵敏度。与国标 法相比本实验实现了利用 C30色谱柱对顺反式维生 素 K1进行分离。本方法中顺式维生素 K1和反式维 生素 K1的检出限分别为 0. 49 μg/kg、0. 29 μg/kg,定 量限分别为 1. 63 μg/kg、0. 95 μg/kg,相关系数均≥ 0. 9978,加标回收率在 87. 5%~117. 6% 之间,精密 度(RSD)在0. 72%~9. 59%之间。该方法样品富集 净化操作简单、灵敏度高、结果准确,能够满足蔬菜 中维生素 K1顺反异构体的检测。




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