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大鼠肝微粒体CYP450酶活性研究-QL-901使用

返回列表 来源:未知 发布日期:2019-12-31 09:29【

白芍-柴胡药对出自 《太平惠民和剂局方》,是临床常 用的药对组合。随着中医药现代化的发展,组分配伍逐渐 成为现代中药配伍研究的热点。柴胡皂苷是柴胡的主要生 物活性成分,具有解热、抗炎、免疫调节、保肝、护肾、 抗肿瘤等药理活性,临床上以保肝作用效果最佳,这与 柴胡疏肝解郁功效一致。白芍的药效成分主要为一组糖苷 类物质,包括芍药苷、芍药新苷和芍药内酯苷等,统称为 白芍总苷。白芍总苷具有镇痛、镇静、抗炎、保肝、免 疫调节、抗氧化和抗心肌缺血等药理作用,已经作为抗 炎免疫调节药被正式批准生产上市。


1 材料 


1. 1 药 物 柴 胡 皂 苷

( 柴胡总皂苷粗提物,批 号 HY20150510,规格 50%,西安皓源生物技术有限公司,临 用时用蒸馏水稀释成所需浓度的混悬液) ; 白芍总苷 ( 本 实验室自制所得,其中芍药内酯苷含有量 15. 2%,芍药苷 含有量 42. 6%,使用前用蒸馏水溶解并稀释至所需浓度) , 苯巴 比 妥 钠 注 射 液 [天津金耀药业有限 公 司,批 号 1601041 ( A1) ,规格 0. 1 g /mL]。

1. 2 动物

雄性 SD 大鼠,清洁级,体质量 ( 180±20) g,由河北省实验动物中心提供,实验动物生产许可证 SCXK ( 冀) 2013-1-003,合格证编号 1604066,实验动物使用许 可证 SYXK ( 冀) 2011-0047。饲养于河北省中药配方颗粒 工程技术研究中心动物室,动物室为万级洁净屏障系统, 恒温恒湿 ( 室温 22 ~ 25 ℃,相对湿度 45% ~ 55%,明暗交 替各 12 h) ,大鼠自由摄食饮水。严格按照实验动物的要求 及实验动物饲养规则饲养和管理。


1. 3 试剂

谷丙转氨酶 ( ALT) 、谷草转氨酶 ( AST) 、超 氧化物歧化酶 ( SOD) 、丙二醛 ( MDA) 及 BCA 蛋白浓度 测试 盒 ( 南京建成生物工程研究所,批 号 20170603、 20170530、20170803、20170806、20170425 ) ; 氯 唑 沙 宗 ( 含有量> 98. 0%,批号 8SB8A-LR,东京化成工业株式会 社) ; 非那西丁 ( 含有量>99. 0%,批号 IL7FG-PD,上海化 成工业发展有限公司) ; 甲苯磺丁脲 ( 含有量 97. 5%,批 号 L220Q60,北京百灵威科技有限公司) ; 氨苯砜 ( 含有量 99. 5%,批号 SZBD156XV,Sigma 公司) ; 东莨菪內酯 ( 含 有量>98. 0%,批号 151208,成都普菲德生物技术有限公 司) ; β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐 ( NADP) ( 批 号 L9A0N17,美 国 Sigma 公 司) 、葡 萄 糖-6-磷 酸 脱 氢 酶 ( G-6-PDH) ( 批号 LR60Q94,北京百灵威科技有限公司) ; 葡萄糖-6-磷酸 ( G-6-P) ( 批号 L490O130,北京百灵威科 技有限公司) ; 甲醇、乙腈为色谱纯; 超纯水由 Milipore 超 纯水系统制备; 其他试剂均为分析纯。


1. 4 仪器

ST-360 酶联免疫检测仪 ( 上海科华生物工程 股份有 限 公 司) ; AU2700 型全自动生化分析仪 ( 日 本 Olympus公司) ; LC-15C 高效液相色谱仪 ( 日本岛津公司) ; LC-15C 泵、SPD-15C 型 紫 外 检 测 器、SIL-10AF 自 动 进 样 器、CTO-15C 柱温箱 ( 日本岛津公司) ; Optima XPN -100 Ultracentrifuge 超高速冷冻离心机 ( 美国 Beckman 公司) ; H2050R 高速离心 机 ( 湖南赛特湘仪离心机仪器有限公 司) ; MS-100 恒温混匀仪 ( 杭州奥盛仪器有限公司) ; QL901 型涡旋混合器 ( 海门市其林贝尔仪器制造) ; TB-215D 电子天平 ( 德国赛多利斯公司) ; PRO200 型手持式匀浆器 ( 美国 PRO 公司) 。


2 方法

2. 1 分组、给药

SD 大鼠 50 只,雄性,适应性饲养 7 d 后,按体质量随机分为空白对照组、柴胡皂苷组、白芍总 苷组、柴胡皂苷-白芍总苷配伍组、苯巴比妥钠组,每组 10 只。其中空白对照组灌胃给予相同体积的 0. 9%氯化钠溶 液; 苯巴比妥钠组给药剂量为 80 mg /kg,腹腔注射给药, 1 次/d,连续 4 d; 柴胡皂苷组、白芍总苷组给药剂量均为 500 mg /kg ( 其剂量是依据临床使用剂量放大 4 ~ 5 倍,并 折算成大鼠的等效剂量) ; 柴胡皂苷-白芍总苷配伍组给药 剂量 为 500 mg /kg ( 柴 胡 皂 苷、白芍总苷配伍比例为 1 ∶ 1) ,灌胃给药,连续 15 d。

2. 2 肝脏指数测定

大鼠末次给药禁食、自由饮水 24 h 后,称量每只大鼠的体质量,处死并开腹取出肝脏,进行 肝脏形态的大体观察,4 ℃ 生理盐水去除肝脏表面残血,用滤纸吸干水分后称定质量,计算肝脏指数。肝脏指数 = [大鼠肝脏质量 ( g) /大鼠的体质量 ( g) ] ×100%。


2. 3 对大鼠肝微粒体 CYP450 亚酶活性的影响

制备大鼠肝微粒体前,将所用 试剂和器械置于 4 ℃ 以下预冷。按照差速离心法制备大鼠 肝微粒体,取适量肝脏称重,立即置于冰冷的蔗糖溶液 中清洗,剪碎,反复清洗至土黄色; 然后加 4 倍肝重的蔗 糖溶液,在冰浴中用组织匀浆器制成匀浆; 在 14 000 g、 4 ℃离心 20 min; 弃去沉淀,上清液在 4 ℃以下 100 000 g, 离心 60 min; 弃去上清液,沉淀悬浮于含 20%甘油的 TrisHCl 缓冲液 ( 0. 1 mol /L Tris) 中,反复在冰水浴中吹打均 匀,分装,-80 ℃保存备用。用 BCA 试剂盒测定肝微粒体 蛋白浓度。


3 结果


在给药 15 d 后, 各组大鼠体质量变化无明显差异 ( P>0. 05) 。与空白对照 组相比,除苯巴比妥组大鼠肝脏指数显著升高 ( P<0. 01) 外,其他各给药组无明显差异 ( P>0. 05) 。见表 1。

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与空白对照组比 较,柴胡皂苷组、白芍总苷组及柴胡皂苷-白芍总苷配伍组 肝组织中 MDA 水平显著增高 ( P< 0. 05) ,肝组织中 SOD水平显著降低 ( P<0. 05) ,提示柴胡皂苷与白芍总苷所致 肝功损伤与氧化损伤机制有关。


4 讨论 


中药成分复杂,若采用饮片进行药理研究干扰因素很 多,组分配伍不仅是现代中药配伍研究的热点,也可在实 验研究中减少影响因素的干扰。肝脏是药物代谢的主要器官,其中细胞色素 p450 酶系统 ( CYP450) 是多种药物在 体内代谢的主要酶系。CYP450 酶的活性直接影响药物清 除,国内外均要求测定药物对 CYP 酶活性的影响,作为临 床合理联合用药的依据。




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