用VORTEX-5对胺复合物在动物体内的分析

脑胶质瘤是颅内常见的发生于神经外胚层的 恶性肿瘤，临床上常采用手术治疗，并结合放疗 和化疗等手段。由于颅内禁区多，手术难度大且 不能彻底，加之脑胶质瘤的浸润性生长，预后差， 因此化疗在肿瘤的治疗过程中显得日益重要。然 而目前临床上常用的抗肿瘤药物难以在脑胶质瘤 部位形成高浓度，治疗效果不理想。因此构建针 对脑胶质瘤的靶向递药系统显得十分必要。

1 材料与仪器 

1.1 材料 

聚酰胺-胺(PAMAM G5.0，Mw=28 824.81，美 国 Sigma 公司，批号：MKBS5794)；BO(江西聚鹏 天然香料油有限公司，批号：130910；纯度>97%)； FA、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐 [1-(3dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC·HCl]、N-羟基琥珀酰亚胺 (N-Hydroxysuccinimide，NHS)、丁二酸酐(succinic anhydride，SA)(上海阿拉丁公司，批号分别为 C1405036，K2425066，C1405036；纯度>98%)； 盐酸阿霉素(DOX·HCl，浙江海正制药有限公司， 批号：121210；纯度>98%)；DOX·HCl 对照品 (DOX ，中国食品药品检定研究院，批号： 130509-200306；纯度>98%)；柔红霉素(DNR，内 标，大连美仑生物技术有限公司，批号：20120813； 纯度>98%)；肝素钠(常州千红生物制药股份有限 公司，批号：120308)；水合氯醛(天津永大化学试 剂有限公司，批号：20120521)；生理盐水(河北天 成药业股份有限公司，批号：A12062504)；甲醇、 乙腈(美国 Honeywell Burdick & Jackson 公司，色 谱纯，批号分别为 130296，13620741)；磷酸(色谱 纯，美国 TEDIA 公司，批号：504506)；其他试剂 均为分析纯。 

1.2 仪器 

Agilent 1200 高效液相色谱仪(美国 Agilent 公 司)；Mill-Q 超纯水仪(美国 Millpore 公司)；pH 酸 度计(瑞士 Mettler-Toledo 公司)；Thermo Forma 超 低温冰箱(美国 Thermo Fisher Scientific 公司)； CP225D 电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公 司)；TGL-16B 高速台式离心机(上海安亭科学仪器 厂)；VORTEX-5 型涡旋混合器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；2XZ-2 型真空干燥箱、氮气吹 扫仪(临海市谭式真空设备有限公司)；高速组织匀 浆机(上海净信科技有限公司)；KQ5200DE 型数控 超声波清洗器(上海超声仪器有限公司)。 

1.3 细胞和实验动物 

大鼠脑胶质瘤C6细胞由浙江中医药大学动物中心提供。动物种属及来源：Wistar 大鼠 12 只，♂，清 洁级，体质量(220±10)g，购自浙江中医药大学动 物中心，合格证号：SCXK(沪)2013-0016。

2 方法 

2.1 FA-BO-PAMAM 的合成 

称取 SA 2.0 g 溶于 50 mL 无水二氯甲烷中， 加入等摩尔的二甲氨基吡啶(DMAP)和三乙胺 (TEA)，同时称取 500 mg BO 加入到上述溶液中， 室温下油浴反应 48 h，得产物 BO-SA。取 BO-SA 30 mg 溶于 DMF 后，与 5 倍当量的 EDC 和 NHS 的 PBS(pH=5.7)溶液混合，室温下活化反应 2 h 后， 正己烷萃取得 BO-SA 活性酯。取以上活性酯加入 到 PAMAM(64∶1)的水溶液中，室温过夜反应后 转移到透析袋中(Mr=3 500)，用超纯水透析 24 h， 冻干得到白色固体产物 BO-PAMAM。 FA 分子与 PAMAM 的合成依照所述。 称取 FA 2 mg 溶于 4 mL DMF 和 DMSO 的混合溶 液中(3∶1)，然后加入 5 倍当量的 EDC，室温下活 化反应 3 h 。将活化的反应液逐滴加入到 BO-PAMAM 的水溶液中，反应 24 h 后，用大量 的水透析 24 h，将透析液冻干得到黄色的固体产 物 FA-BO-PAMAM。 

2.2 FA-BO-PAMAM/DOX 的制备 

准确称取 DOX·HCl 1 mg(记为 W0)，溶解于 2 mL DMSO 和 3 倍当量的 TEA 的混合溶剂中， 室温搅拌过夜后逐滴加入到各载体的 DMSO 溶液 中，避光反应 24 h。反应结束后，向反应液中加 入超纯水，再用乙酸乙酯萃取除去游离的 DOX， 冷冻干燥后得到深红色的冻干品，称重(记为 W)。 UV 测定载药复合物在 501 nm 处的吸光度，计算 出载体中所含的药量(记为 W1)，从而计算载药量 和包封率。

2.3 体内样品色谱条件 

色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB C18柱(250 mm× 4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.01 molL1 磷酸 二氢钠 ( 磷酸调 pH 至 3.0)(29∶71) ；流速： 1.0 mLmin1 ；柱温：25 ℃；检测波长：激发波长 498 nm，发射波长 556 nm；进样量：20 μL。

3 结果 

3.1 载药量和包封率的测定 

利用 UV 测定的 BO-PAMAM/DOX 和 FA-BOPAMAM/DOX 的载药量分别为 (6.69±0.35)%和 (6.64±0.09)% ，包封率分别为 (68.40±5.31)% 和 (64.58±0.85)%(n=3)。 

3.2 方法的专属性 

将空白血浆和组织的色谱图与加入 DOX 和 DNR 的色谱图，以及给药后得到的血浆和组织的 色谱图进行比较。DOX 与 DNR 的峰 形较好，分离度>1.5，且空白血浆和组织对测定无 干扰。

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