用XW-80A对酪酸梭菌双岐杆菌二联活菌研制

1 材料与方法 

1． 1 药品和仪器 

酪酸梭菌双岐杆菌二联活菌购 于山东科兴生物制品公司; 米非司酮由深圳市资福 药业有限公司提供; Hamster Anti-mouse CD3e FITC、 Ｒat Anti-Mouse CD4 PE-CYTM5、Ｒat Anti-Mouse CD8a PE-CYTM7 ( 美 国 BD Pharminge 公 司) ; Anti-Mouse CD279 PE、Anti-Mouse CD28 PE( 美国 e Bioscience 公司) ; 小鼠红细胞裂解液( Biosharp 公司) ; 高速低 温离心机、各种规格移液器( 美国 Thermo Fisher 公 司) ; Beckman Coulter FC500 流 式 细 胞 仪 ( 美 国 Beckman Coulter 公司) ; 台式低速离心机( 湘仪离心 机器械厂) ; XW-80A 旋涡混合仪( 海门市其林贝尔仪器制造公司) 。 

1． 2 动物 

8 周龄 SPF 级 BALB /c 健康成年小鼠 ( 雌性 18 只，雄性 9 只) ，体质量 18 ～ 22 g( 江苏省 南京市青龙山动物饲养中心提供) ，雌雄小鼠采用 2 ∶ 1 配对饲养。 

1． 3 早产及足月小鼠造模 

用米非司酮( ＲU486) 腹腔注射无菌孕鼠建立早产模型。雌鼠检查到 阴栓记为妊娠第 1 天，单笼饲养，随机选择部分孕鼠 于孕第 18 天及第 19 天晨 8 点腹腔注射用蓖麻油溶 解的米非司酮( 剂量 0． 15 mg /kg，) ，获得胎龄 ＜ 20 d 的新生早产小鼠。另外的孕鼠待其自然分娩，收 集胎龄 ＞ 20 d 的新生足月小鼠。 

1． 4 分组及给药 

随机将 P1 早产小鼠分为早产实 验组( Ⅰ组) 和早产对照组( Ⅱ组) ，同日龄足月小鼠 为足月对照组( Ⅲ组) ，每组 16 只。Ⅰ组给予酪酸 梭菌双岐杆菌二联活菌灌胃 ( 灌胃体积为 100μL /10g) ，同一时间，给予Ⅱ组与Ⅲ组等量生理盐水 灌胃，均于灌胃后按窝返回母鼠身边饲养。 

1． 5 取血 

各组分别在 P14、P21 随机选取小鼠 8 只，乙醚麻醉，眼球取血法取血 ＞ 500 μL，EDTA-K2 抗凝后，置于冰上备用。 

1． 6 CD28 和 PD1 分子检测 

取 2 只流式管分别 标为①、②，向两管中各加入 100 μL stain buffer、荧 光标记的抗体 CD3e-FITC、CD4-PEcy5、CD8-PEcy7 各 1 μL; 再向①管中加入 1 μL CD279-PE，②管加入 1 μL CD28-PE; 两管中各加入外周血 100 μL，避光 孵育 20 min; 两管分别加入鼠红细胞裂解液 2 mL， 裂解 2 min，1500 rpm 离心 5 min，重复 1 次; 两管加 stain buffer 各 2 mL，1500 rpm 离心 5 min，倒去上清 液，重复 1 次; 两管加 stain buffer 各 700 μL 后上机 检测; 采用 Flow Jo VX 软件进行 CD28、PD1 的表达 量分析。 

1． 7 统计方法 

采用 GraphPad Prism 6． 0 软件进 行统计分析，用 Holm-Sidak 检验进行多组间两两比 较，两组间、组内比较用独立样本 t 检验。P ＜ 0． 05 为差异有统计学意义。

2 结果 

2． 1 早产对小鼠 CD4 + T 细胞表面 CD28 表达水平 的影响 

为新生小鼠 CD4 + T 细胞 表面 CD28 表达图。在 P14，Ⅱ组小鼠 CD4 + T 细胞 表面 CD28 的表达与Ⅲ组比较差异无统计学意义( P = 0． 073) ; 而在 P21，Ⅱ组 CD28 的表达量高于Ⅲ组 ( P = 0． 040) 。并且Ⅱ组 CD28 的表达量随 日龄的增加而升高( P = 0． 024) ; 而Ⅲ组 CD28 的表 达随着时间的延长未见明显变化( P = 0． 108) 。 

2． 2 早产对小鼠 CD4 + T 细胞表面 PD1 表达水平的影响 

新生小鼠 CD4 + T 细胞 表面 PD1 表达图。在 P14，Ⅱ组小鼠 CD4 + T 细胞表面 PD1 的表 达 与Ⅲ组比较差异无统计学意义( P = 0． 225) ; 而在 P21，早产对照组 PD1 的表达量高于Ⅲ 组( P =0． 000) 。并且Ⅱ组 PD1 的表达量随 日龄的增加升高( P = 0． 000) ; 而Ⅲ组 PD1 的表达随 着时间的延长未见明显变化( P =0． 393) 。

2． 3 酪酸梭菌双岐杆菌二联活菌对早产小鼠 CD4 + T 细胞表面 CD28 表达的影响 

在 P14 和 P21，Ⅰ组 CD4 + T 细胞表面 CD28 的表达均 高于Ⅱ组( t = 6． 784，t = 4． 577，P 均 = 0． 000) 和Ⅲ 组( t = 4． 315，t = 6． 746，P 均 = 0． 000) 。 而Ⅰ组 CD28 的表达在 P14 与 P21 未见明显差异( t= 1． 567，P = 0． 139) 。

3 讨论 

酪酸梭菌双岐杆菌二联活菌是酪酸梭状芽孢杆婴儿型双歧杆菌混合制剂，可以促进肠道有益 菌的生长，维持肠道菌群的平衡，对肠道内病原菌的 抑制有显著作用。Ling 等发现酪酸梭菌双歧 杆菌混合物可能是治疗抗生素相关性腹泻( AAD) 的一种简单有效的方法。有临床研究表明，肺炎 住院儿童在应用抗生素的基础上加用酪酸梭菌双岐 杆菌二联活菌，可有效降低其发生 AAD 的风险，未发现其不良反应。

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